糙柱花草遺傳多樣性SSR分析

丁西朋+羅小燕+張龍+王文強+白昌軍

摘 要 為鑒定糙柱花草種質的遺傳背景和親緣關系，提高其利用效率，利用來自不同柱花草種中的16個SSR標記對14份糙柱花草種質進行遺傳多樣性和聚類分析。結果表明：在16個SSR標記中，10個SSR標記在14份糙柱花草種質間具有多態性。10個多態性SSR標記共檢測到32個等位基因，每個標記可檢測到2～8個等位基因，平均為3.20個；每個SSR標記的Shannon信息指數（I）和多態性信息含量（PIC）分別為0.191～0.796和0.173～0.769，平均為0.474和0.411。14份糙柱花草種質間的遺傳相似系數為0.438～0.938，平均為0.733。聚類分析結果顯示，在遺傳相似系數為0.74處，14份供試糙柱花草種質可明顯被分為3類，其中III類中的CPI 93116柱花草與其他種質遺傳關系較遠。

關鍵詞 糙柱花草 ；種質資源 ；SSR標記 ；遺傳多樣性

分類號 S54

Stylosanthes scabra Genetic Diversity Analysis by SSR Markers

DING Xipeng LUO Xiaoyan ZHANG Long WANG Wenqiang BAI Changjun

（Institute of Tropical Crops Genetic Resources， CATAS， Danzhou， Hainan 571737）

Abstract To identify the genetic background and relationship of Stylosanthes scabra varieties and promote the further utilization of them， the genetic diversity of 14 S. scabra varieties was analyzed using 16 SSR markers developed from other different Stylosanthes species. Result： Among 16 SSR markers， 10 markers were polymorphic among 14 S. scabra materials. A total of 32 alleles were generated by the 10 polymorphic markers， and the number of alleles of SSR markers ranged from 2 to 8 with an average of 3.20 alleles. The Shannon's information index and polymorphic information content each polymorphic SSR marker varied from 0.191 to 0.796 and 0.173 to 0.769， with an average of 0.474 and 0.411， respectively. The genetic similarity coefficients of 14 S. scabra materials were from 0.438 to 0.938 with an average of 0.733. The cluster analysis showed that the 14 S. scabra materials could be obviously divided into 3 clusters at genetic similarity coefficient of 0.74. The lower genetic relation was presented between S. scabra CPI 93116 in cluster III and other S. scabra materials.

Keywords Stylosanthes scabra ；germplasm ； SSR marker ； genetic diversity

糙柱花草具有很強的抗旱性，是熱帶地區放牧草地應用最廣泛的柱花草種[1]。西卡柱花草（Styosanthes scabra‘Seca）是由中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所引進選育而成的優良糙柱花草品種，是華南干旱、半干旱地區人工草地建設和天然草地改良的首選草種，在海南、云南、廣東、廣西、四川、貴州、福建等省區累計推廣面積超過1萬hm2[2-3]。糙柱花草為異源四倍體，其二倍體祖先為粘質柱花草（Styosanthes viscosa）和灌木柱花草（S. seabrana）[4]。糙柱花草為典型的自花授粉植物，異交率僅為1%～2%[5]。目前為止，對糙柱花草種質資源遺傳多樣性研究的報道非常少。Maass[6]通過對糙柱花草的形態指標及農藝性狀經常考察及聚類分析，最終將糙柱花草資源分為4類；Liu[1]利用21對RAPD標記將93份糙柱花草資源分為5類。SSR標記作為一種重要的分子標記技術，具有數量豐富、多態性高、共顯性、操作簡單等優點，已經被廣泛于遺傳學研究的諸多領域[7]。在柱花草中已報道的可用SSR標記共139個，其中44個來自圭亞那柱花草、26個來自大頭柱花草（S. macrocephala）、23個來自灌木柱花草、23個來自頭狀柱花草（S. capitata），其他的來自其他14個不同的柱花草種[8-14]，這些SSR標記主要應用于柱花草種質資源遺傳多樣性分析和核心種質的構建。Chandra等[8]利用開發的41個SSR標記對灌木柱花草的20份種質進行了遺傳多樣性分析。Santos-Garcia等[15]利用20個SSR標記對圭亞那柱花草資源進行了遺傳多樣性及聚類分析，將150圭亞那柱花草分為9 類。Santos-Garcia等[16]利用SSR標記對134份大頭柱花草種質和192份頭狀柱花草種質進行了遺傳多樣性分析，構建了分別含有23份大頭柱花草和13份頭狀柱花草的核心種質。但SSR標記在糙柱花草種質資源中的開發及應用尚未見報道。本課題組對123個在其他柱花草種中開發的SSR標記進行篩選，結果獲得了79個在糙柱花草中能有效擴增的SSR標記[17]。在本研究中，利用其中16個在糙柱花草中能有效擴增、條帶清晰且多態性較好的SSR標記對14份糙柱花草種質資源的遺傳背景及親緣關系進行鑒定，為糙柱花草資源的引進及利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用14份糙柱花草種質包含3個栽培品種（西卡柱花草、費特羅雷柱花草和斯倫柱花草）和其他11份資源（表1），其中3份糙柱花草種質為中國熱帶農業科學院（CATAS）熱帶作物品種資源研究所收集，6份引自澳大利亞國際熱帶農業研究中心（ACIAR），5份引自哥倫比亞國際熱帶農業中心（CIAT）。14份糙柱花草種質資源均種植在中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所熱帶牧草研究中心基地，按照日常大田管理辦法進行管理。

1.2 SSR擴增與分析

采集糙柱花草苗期的新鮮葉片置于液氮中，按本實驗室改良CTAB 法提取柱花草的基因組DNA[17]，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoVue超微量分光光度計（GE Healthcare）檢測DNA的質量和濃度，將DNA稀釋至50 ng/μL后置于-20℃備用。從張龍等[17]篩選獲得的在8個不同柱花草種中都能有效擴增且條帶清晰的SSR標記中，挑選16個SSR標記對14份糙柱花草種質資源進行遺傳多樣性分析（表2），引物由上海生工生物工程公司合成。PCR擴增條件及程序根據丁西朋等[18]描述的方法進行，采用20 μL的PCR反應體系：50 ng/μL模板DNA 1 μL，5 μmol/μL上下游混合引物0.8 μL，2.5 μmol/μL dNTPs 1.2 μL，10×PCR Buffer 2 μL，5 U/μL Taq聚合酶0.2 μL，最后用ddH2O補足。PCR反應程序為：94℃預變性4 min；94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸45 s，35個循環；最后72℃延伸10 min。擴增產物用8% PAGE（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，聚丙烯酰胺凝膠電泳）電泳后，采用硝酸銀染色法進行顯影，最后拍照記錄。

1.3 數據分析

以DL2000 DNA marker作為擴增產物片段大小的參考，對大小合適、清晰且易于辨認的譜帶采用“0，1”系統記錄，無條帶記為“0”，有條帶記記為“1”。將記錄的原始數據匯總到Excel表格中生成數據矩陣，用于擴增條帶的多態性比較和聚類分析。利用NTSYS-pc 2.10e軟件分析糙柱花草種質間的遺傳相似系數（Genetic similarity coefficient，GS），然后根據GS值采用非加權組平均法（Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Means，UPGMA）對供試糙柱花草材料進行聚類分析[19]。利用POPGENE 1.32軟件計算每個位點的遺傳多樣性參數，包括等位基因數、等位基因頻率和Shannon信息指數（I）[20]。每個位點的多態性信息含量（Polymorphic Information Content，PIC）按如下公式進行計算：

PIC=1-（Pi2）-2Pi2Pj2

其中，n表示每個位點檢測到的等位基因數目，Pi、Pj表示第i、j個等位基因在供試材料中出現的頻率[21]。

2 結果與分析

2.1 SSR擴增結果

本研究利用16個SSR標記對14份糙柱花草種質資源進行了遺傳多樣性分析（圖1）。結果表明：選用的16個SSR標記中，有10個SSR標記在14份糙柱花草材料中具有多態性。由表3可知，這10個多態性SSR標記共產生等位基因32個，每個標記檢測到的等位基因數為2～8個，平均為3.20個。10個多態性SSR標記的I值和PIC值的變化范圍分別為0.191～0.796和0.173～0.769，平均為0.474和0.411。I值和PIC值都以標記SSR5最大，標記SSR109最小，表明SSR5具有較高的多態性檢測效率。

2.2 遺傳多樣性分析結果

基于10個多態性SSR標記的帶譜，利用NTSYS-pc 2.10e對14份糙柱花草種質資源進行了遺傳多樣性分析。結果表明，14份糙柱花草種質資源間的遺傳相似系數GS為0.375～0.938，平均為0.733（表4）。其中CPI 33260與費特羅雷柱花草（0.938）、CIAT 1077與CIAT 1080（0.938）的遺傳相似性最大。而費特羅雷柱花草（0.375）、TPRC250（0.438）、CPI 33260（0.438）、Q10042（0.469）、CIAT 1077（0.469）和CIAT 1080（0.469）與CPI 93116的遺傳相似系數最低，均在0.500以下。從各糙柱花草種質間平均相似系數來看，CPI 93116與其他材料的平均相似系數最低，為0.488，表明CPI 93116與其他種質的親緣關系最遠；其次為品153柱花草，為0.685。其余材料的平均相似系數均大于0.700，其中Q10042、CIAT 1077和CIAT 1080最高，達0.796。

2.3 聚類分析結果

由圖2可知，14份糙柱花草種質資源在相似系數為0.74處可明顯分為3大類群。第I類群包括10份材料，在相似系數為0.80處可分為2個亞類：I-A亞類包含6份材料，其中西卡柱花草和CIAT 66聚在一起，CPI 40292、CIAT 1077、CIAT 1077和CIAT 1080聚在一起；I-B亞類包含4份材料，其中Q10042與斯倫柱花草的親緣關系較近，而CPI 33260與費特羅雷柱花草的親緣關系更近。第II類群包括3份材料，在相似系數為0.80處，品153和TPRC 250可歸為II-A亞類，而CIAT 1355單獨歸為II-B亞類。第III類群僅1份材料CPI 93116，這份材料同其他供試材料的遺傳關系最遠。

3 討論與結論

分子標記是作物遺傳學研究和分子育種的重要工具，相對于其他基于PCR的分子標記，SSR標記具有數量豐富、多態性高、共顯性、操作簡單、重復性好等優點，這使SSR技術在種質資源遺傳多樣性分析、指紋圖譜構建、基因定位及遺傳圖譜的構建等多個領域得以應用[7]。糙柱花草是熱帶地區重要的放牧型豆科牧草，當前糙柱花草SSR標記的缺失極大地限制了人們對糙柱花草分子水平的認識。SSR標記的開發一般需要大量的堿基序列作為基礎，然而SSR引物在近緣種間具有一定的通用性，因此，對遺傳學基礎較弱的物種，近緣物種轉移法已成為一種成本低廉、簡便快速獲得SSR標記的有效途徑[22]。鐘敏等[23]通過對1 205個綠豆SSR標記進行篩選，獲得了603、883和983個分別在豇豆、小豆和飯中可用的SSR標記。Sharma等[24]研究結果表明，98個水稻SSR標記和20個甘蔗SSR標記在竹子中的通用性比率分別為44.9%和75%。本課題組對123個在其他柱花草種中開發的SSR標記進行了篩選，獲得了79個在糙柱花草中能有效擴增的SSR標記[17]。利用其中16個SSR標記對14份糙柱花草種質資源的遺傳背景及親緣關系進行鑒定，結果表明，在16個SSR標記中，有10個SSR標記在14份糙柱花草材料中具有多態性，每個多態性標記可檢測到2～8個等位基因，PIC值的變化范圍為0.173～0.769，平均為0.411。利用這10個多態性SSR標記能夠有效地對14份糙柱花草種質資源進行區別鑒定，表明利用近緣物種轉移法獲得的糙柱花草SSR標記不僅具有較高的多態性，且能夠成功用于糙柱花草種質資源的遺傳多樣性分析。

由于柱花草屬植物分布廣泛、種類繁多、植物學特征復雜多變，所以基于傳統的形態學特征分類方法很難對柱花草屬內種和亞種進行區分鑒定，所以許多學者通過分子標記方法對柱花草種間遺傳關系進行了研究[25-26]。如灌木柱花草和糙柱花草有著非常相似的生態學特征，包括生長習性、莢果性狀、均為多年生等[27]，所以根據形態特征很難對它們進行區分，直到2002年，灌木柱花草才被確定為一個新種[28]。Chandra等[27]利用STS標記和流式細胞儀從48份糙柱花草種質資源中鑒定出10份灌木柱花草。Liu[1]利用RAPD標記對100份糙柱花草資源進行分析，從中分離鑒定出7個錯誤種質，將剩下的93份種質分為5個類群，說明相對于形態學指標，分子標記技術在種質資源鑒定中更有效。本研究利用16個SSR標記對14份糙柱花草種質進行了遺傳多樣性分析，將它們分為3個大類，5個小群，該結果與Liu的研究結果類似。14份糙柱花草種質的來源和聚類結果并不一致，這可能是不同地區種質資源互相交流的原因。

綜上所述，對于遺傳學基礎較弱的糙柱花草，利用同屬柱花草的SSR標記來分析糙柱花草的遺傳信息，是一種成本低廉、簡便快速的有效途徑。本課題組利用近緣物種轉移法從其他柱花草中獲得了糙柱花草SSR標記，本研究將其中16個條帶清晰且多態性較好的SSR標記成功應用于糙柱花草種質資源的遺傳多樣性分析，能有效地對糙柱花草資源進行區分鑒定。本研究結果將有助于糙柱花草種質資源遺傳多樣性、親緣關系鑒定、基因發掘與定位及分子輔助植物育種等研究的開展。

參考文獻

[1] Liu C J. Geographical distribution of genetic variation in Stylosanthes scabra revealed by RAPD analysis[J]. Euphytica， 1997， 98（1）： 21-27.

[2] 白昌軍，劉國道.西卡柱花草[J].農家顧問，2004，1（1）：28-29.

[3] 白昌軍，劉國道，王東勁，等.西卡柱花草選育及其利用評價[J].草地學報，2004，12（3）：170-175.

[4] Liu C J， Musial J M. Stylosanthes sp. aff. S. scabra：a putative diploid progenitor of Stylosanthes scabra （Fabaceae）[J]. Plant Systematics and Evolution， 1997， 208（1）： 99-105.

[5] Stace H M. Breeding systems in Stylosanthes. I. Observations of outcrossing in S. scabra at an alcohol dehydrogenase locus[J]. Australian Journal of Agricultural Research， 1982， 33（1）： 87-96.

[6] Maass B. The tropical forage legume Stylosanthes scabra Vog.-variability， performance and possibilities for improvement by plant breeding[D].Gottingen： Universitat Gottingen， 1989.

[7] Kalia R K， Rai M K， Kalia S， et al. Microsatellite markers：an overview of the recent progress in plants[J]. Euphytica，2011，177（3）：309-334.

[8] Chandra A，Tiwari K K，Nagaich D，et al. Development and characterization of microsatellite markers from tropical forage Stylosanthes species and analysis of genetic variability and cross-species transferability[J]. Genome， 2011， 54（12）： 1 016-1 028.

[9] Santos M O， Karia C T， Resende R M， et al. Isolation and characterization of microsatellite loci in the tropical forage legume Stylosanthes guianensis（Aubl.）Sw[J]. Conservation Genetics Resources，2009， 1（1）： 43-46.

[10] Vander S J， Weltjens I， Volckaert G. Microsatellite markers in Stylosanthes guianensis[J]. Molecular Ecology， 1999， 8（3）： 514-517.

[11] Santos M O， Sassaki R P， Ferreira T H S， et al. Polymorphic microsatellite loci for Stylosanthes macrocephala Ferr. et Costa， a tropical forage legume[J]. Conservation Genetics Resources， 2009， 1（1）： 481-485

[12] Santos M O， Sassaki R P， Chiari L， et al. Isolation and characterization of microsatellite loci in tropical forage Stylosanthes capitata Vogel [J]. Molecular Ecology Resources， 2009， 9（1）： 192-194.

[13] Billotte N， Lagoda P J R， Risterucci A M， et al. Microsatellite-enriched libraries：applied methodology for the development of SSR markers in tropical crops[J]. Fruits， 1999， 54（2）： 277-288.

[14] Mace E S， Varshney R K， Mahalakshmi V， et al. In silico development of simple sequence repeat markers within the aeschynomenoid/dalbergoid and genistoid clades of the Leguminosae family and their transferability to Arachis hypogaea， groundnut[J]. Plant Science， 2008， 174（1）： 51-60.

[15] Santos-Garcia M O， Karia C T， Resende R M， et al. Identification of Stylosanthes guianensis varieties using molecular genetic analysis[J]. AoB Plants， 2012： pls001.

[16] Santos-Garcia M O， Toledo-Silva G， Sassaki R P， et al. Using genetic diversity information to establish core collections of Stylosanthes capitata and Stylosanthes macrocephala[J]. Genetic and Molecular Biology， 2012， 35（4）： 847-861.

[17] 張 龍，丁西朋，嚴琳玲，等. 8種柱花草屬牧草SSR-PCR反應體系優化及引物篩選[J]. 草業科學，2014，31（2）：233-242.

[18] 丁西朋，羅小燕，邵辰光，等. Genomic-SSR和EST-SSR在柱花草種間的遺傳差異[J]. 廣東農業科學，2015，42（14）：106-113.

[19] Rohlf F J. NTSYS-pc Numerical taxonomy and multivariate analysis system， version 2.10[M]. New York：Exeter Software， 2000.

[20] Yeh F C， Yang R C， Boyle T. POPGENE， version 1.32： the user friendly software for population genetic analysis[M]. Canada：Molecular Biology and Biotechnology Centre， University of Alberta， Edmonton， AB， 1999.

[21] Botstein D， White R L， Skolnick M， et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. The American Journal of Human Genetics， 1980， 32（3）： 314-331.

[22] 鄧紹勇，溫 強，李康琴，等. 大青屬植物通用性SSR引物篩選及應用[J]. 中草藥，2014，45（22）：3 317-3 322.

[23] 鐘 敏，程須珍，王麗俠，等. 綠豆基因組SSR引物在豇豆屬作物中的通用性[J]. 作物學報，2012，38（2）：223-230.

[24] Sharma R K， Gupta P， Sharma V， et al. Evaluation of rice and sugarcane SSR markers for phylogenetic and genetic diversity analyses in bamboo[J]. Genome， 2008， 51（2）： 91-103.

[25] Liu C J， Musial J M， Thomas B D. Genetic relationships among Stylosanthes species revealed by RFLP and STS analyses[J]. Theoretical and Applied Genetics， 1999， 99（7-8）： 1 179-1 186.

[26] Vander S J， Marant S， Volckaert G. Molecular characterization and phylogenetic utility of the rDNA external transcribed spacer region in Stylosanthes（Fabaceae）[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2003， 107（2）： 291-298.

[27] Chandra A， Kaushal P. Identification of diploid Stylosanthes seabrana accessions from existing germplasm of S. scabra utilizing genome-specific STS markers and flow cytometry， and their molecular characterization[J]. Molecular Biotechnology， 2009， 42（3）： 282-291.

[28] Maass B L， Mannetje L. Stylosanthes seabrana（leguminosae：papilionoideae）， a new species from Bahia， Brazil[J]. Missouri Botanical Garden， 2002， 12（4）： 497-500.