一株香蕉內生細菌揮發油成分及抑菌活性研究

劉先寶+蔡吉苗+陳奕鵬+李超萍+黃貴修

摘 要 測定一株香蕉內生細菌BEB99發酵液的石油醚和乙酸乙酯粗提物對香蕉枯萎病菌4號生理小種的（FOC4）菌絲生長和孢子萌發的影響，并測定粗提物中的主要成分。研究結果表明：其發酵液的石油醚和乙酸乙酯粗提物對香蕉枯萎病菌的菌絲生長和孢子萌發均具有明顯抑制作用，可造成病菌菌絲的畸形，抗菌物質濃度為1.67 mg/mL時，其孢子萌發抑制率分別達到92.99%和82.96%。GC/MS分析從粗提物中鑒定到18個成分，其中主要成分包括油酸（14.98%）、油酸乙酯（11.38%）、亞麻油酸乙酯（14.86%）、亞油酸（13.20%）、棕櫚酸（11.36%）和棕櫚酸乙酯（11.26%），及一個未知化學成分。

關鍵詞 內生細菌 ；尖孢鐮刀菌 ；揮發油 ；抑菌活性

分類號 S453.121

Volatile Oil Constituents and Antimicrobial Activity of

Endophytic Bacteria Isolated from Banana

LIU Xianbao CAI Jimiao CHEN Yipeng LI Chaoping HUANG Guixiu

（Environment and Plant Protection Institute / Ministry of Agriculture Key Laboratory of

Integrated Pest Management on Tropical Crops / Hainan Key Laboratory for Monitoring and

Control of Tropical Agricultural Pests， CATAS， Haikou， Hainan 571101， China）

Abstract The petroleum ether and ethyl acetate crude extracts of endophytic bacteria strain BEB99 were got by solvent method， and were tested by agar disc diffusion method for their antimicrobial activities against Fusarium oxysporum （FOC4）. The results revealed that the crude extracts displayed strong inhibitory effect on the mycelial growth and spore germination of FOC4. The pathogenic hyphae grew in abnormal shape and produced sac. The inhibition rate of spore germination were 92.99 % and 82.96% respectively when the concentration of petroleum ether and ethyl acetate crude extracts reach to 1.67 mg/mL. Nineteen ingredients were identified from the petroleum ether crude extract of BEB99 by GC-MS analysis. The relative content of Oleic acid （14.98%）， Ethyl oleate （11.38%）， Linoleic acid （13.20%）， Ethyl linoleate （14.86%）， Palmitic acid （11.36%） and Ethyl palmitate （11.26%） were main composition.

Keywords endophytic bacteria ； Fusarium oxysporum ； volatile oil ；antifungal activities

由尖孢鐮刀菌古巴專化型（Fusarium oxysporum f.sp.cubense，FOC） 侵染引起的香蕉枯萎病是危及香蕉產業發展的毀滅性病害。目前，生產上還未建立對香蕉枯萎病有效的防治方法。結合運用農業防治、生物防治等方法對香蕉枯萎病進行綜合防控已成為國內外的研究熱點[1]。

植物內生細菌是指存在于植物體內或生活史的某一特定階段，存在于植物體內而未引起明顯癥狀的細菌[2]。香蕉植株中存在豐富的內生菌資源[3-4]，內生細菌可通過固氮、溶磷、產鐵載體、產生長素等特性促進植物生長，還可通過占據生態位、代謝產物抑制病原菌生長或誘導植物抗性等防治病害危害，在植物病害的防治方面有著很好的應用前景[5-8]。本實驗室在前期研究工作中從香蕉根中分離到一株內生細菌，經形態和分子鑒定其為勞爾氏菌，盆栽實驗發現，該菌株具有一定促生和生防作用。本研究在此基礎上，以香蕉枯萎病菌作為靶標菌，通過平板檢測分析內生細菌揮發油成分對病原菌菌絲生長和孢子萌發的影響，通過GC-MS技術分析其揮發油的化學成分。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

香蕉內生細菌BEB99和香蕉枯萎病病菌尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種（FOC4），均由本實驗室分離和保存。

1.1.2 培養基和試劑

NA培養基、優化培養基（4 g/L葡萄糖，1 g/L酸水解酪蛋白，0.5 ml/L的1 mol/L MgCl2，1 ml/L的1 mol/L CaCl2，pH 6.5）、PDA、PD培養液、石油醚、乙酸乙酯。

1.2 方法

1.2.1 BEB99菌株發酵液制備

將保存的內生細菌BEB99菌株接入優化平板培養基中，28℃，24 h進行活化。將活化的BEB99菌株接入50 mL優化的液體培養基中（150 mL三角瓶），28℃，180 r/min振蕩培養36 h，制成種子液，再將種子液以7 %的接種量接入優化培養液中，相同條件下培養36 h，制備BEB99菌株的發酵液。

1.2.2 BEB99菌株發酵產物分離

將濃縮的發酵產物用細胞超聲破碎儀破碎后，分別用石油醚、乙酸乙酯有機溶劑250 mL與發酵液等體積混合，在1 000 mL分液漏斗中反復顛倒振蕩30 min，使其萃取充分，靜止過夜，萃取3次，合并有機相，將有機相減壓濃縮成浸膏，用石油醚、乙酸乙酯溶劑定容，備用。

1.2.3 BEB99菌株發酵產物抑菌活性測定及其對菌絲生長影響

將FOC4在PDA平板上培養5 d，用無菌水洗下分生孢子，后用滅菌的紗布過濾除去菌絲體，配成濃度為1×107個/mL的孢子懸浮液。待PDA培養基冷卻至50℃，吸取孢子懸浮液與培養基以1：9的比例混勻后倒入培養皿制成帶菌平板。分別將石油醚、乙酸乙酯提取物稀釋至濃度為25 mg/mL，再將25 mg/mL的石油醚、乙酸乙酯提取物稀釋1、10、20和30倍，各取20 μL滴到滅菌的濾紙片（直徑9 mm）上。待吹干后放置帶菌平板中央，重復3次，以滴加石油醚和乙酸乙酯有機溶劑為對照，28℃培養，5 d后觀察濾紙片周圍有無抑菌圈及其大小。同時用解剖刀切取抑菌圈邊緣的菌絲置于載玻片上，以正常培養生長的菌絲為陰性對照，以含多菌靈培養基上培養的菌絲為陽性對照，在光學顯微鏡下觀察菌絲形態變化。

1.2.4 BEB99菌株發酵產物對FOC4菌株孢子萌發影響測定

抑制孢子萌發作用的測定采用懸滴法。分別取25 mg/mL的石油醚、乙酸乙酯相提取物5、10、15、20 μL到2 mL已滅菌的離心管里，待石油醚和乙酸乙酯溶劑揮干，分別用75 μL無菌水溶解，使提取物濃度分別為1.67、3.33、5.01、6.68 mg/mL。將FOC4孢子懸浮液與不同濃度的提取物等量混合，混勻后吸取20 μL滴加到水瓊脂上（水瓊脂事先滴在玻片上），待干后將玻片倒置放在墊有濕潤濾紙的培養皿中，置25℃條件下保濕培養8 h，統計10個視野中總孢子數和萌發孢子數，計算孢子萌發抑制率。3次重復，以等量無菌水與孢子懸浮液混合為對照。

孢子萌發抑制率（%）=（對照孢子萌發率-處理孢子萌發率）/對照孢子萌發率×100。

1.2.5 BEB99菌株發酵產物揮發油化學成分測定

揮發油化學成分通過美國安捷倫公司GC/MS聯用儀（HP6890/HP5975C）進行測定。色譜柱為AB-INowax（30.0 m×250 μm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱，柱溫50℃（保留2 min），以5℃/min升溫至230℃，保持20 min；汽化室溫度250℃；載氣為高純He（99.999%）；柱前壓5.08 psi，載氣流量1.0 mL/min；進樣量1 μL（乙醚溶液）；分流比20∶1。質譜條件：離子源為EI源，離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70 eV；發射電流34.6 μA；倍增器電壓1 022 V；接口溫度280℃；質量范圍20～450 amu。

2 結果與分析

2.1 BEB99菌株發酵產物分離

本研究共收集內生細菌BEB99發酵液80 L，減壓濃縮破碎后，分別用等體積的石油醚和乙酸乙酯有機溶劑萃取得石油醚相提取物0.1 g，乙酸乙酯相提取物9 g。

2.2 BEB99菌株發酵產物抑菌活性

以香蕉枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種（FOC4）作為靶標菌，采用濾紙片擴散法對不同濃度梯度的提取物進行抑菌活性檢測。實驗結果表明，各濃度梯度的揮發油對靶標菌表現出不同程度的抗菌活性。隨著稀釋梯度的增大，抑菌圈減小，稀釋1、10倍的石油醚和乙酸乙酯相提取物對香蕉枯萎病菌菌絲均有抑制作用，但稀釋20倍的石油醚相提取物對香蕉枯萎病菌菌絲還具有一定抑制作用，而該濃度的乙酸乙酯相提取物對香蕉枯萎病菌菌絲則無抑制作用，在稀釋達到30倍時均無抑制作用，見圖1。

2.3 BEB99菌株發酵產物對FOC4菌絲生長的影響

挑取抑菌圈臨界處的菌絲在光學顯微鏡下觀察，并以多菌靈為陽性對照和生長良好的香蕉枯萎病菌菌絲為陰性對照，可見受抑制的菌絲變形扭曲，新分支處菌絲生長受抑制，隔膜處縊縮，原生質凝聚，而生長正常的菌絲生長茂盛，菌絲伸展良好，形態均勻，直長，光滑（如圖2）。

2.4 BEB99菌株發酵產物對FOC4菌株孢子萌發的影響

實驗結果表明，菌株BEB99提取物對香蕉枯萎病菌分生孢子也具有明顯的抑制作用，并且隨著抗菌物質濃度的提高而增強。分生孢子經濃度為1.67 mg/mL的石油醚、乙酸乙酯相提取物處理8 h后，孢子萌發抑制率分別為92.99 %和82.96%。當抗菌物質濃度達到5.01 mg/mL以上時，孢子萌發抑制率均高達100%（表1）。

2.5 BEB99菌株發酵產物揮發油的化學成分

應用GC-MS技術，對菌株BEB99的揮發油進行成分分析，并通過歸一化法確定各成分的相對百分含量（表2）。共得到19個色譜峰（圖3），鑒定出18個成分，還有一個未知化學成分，占總油量的97.958%。菌株BEB99揮發油中的組分復雜多樣，以酯類、酸類化合物為主，其中酯類6種，酸類9種，醛類2種。相對含量超過10%的有油酸（14.98%）、油酸乙酯（11.38%）、亞麻油酸乙酯（14.86%）、亞油酸（13.20%）、棕櫚酸（11.36%）和棕櫚酸乙酯（11.26%）。

3 討論與結論

目前，有關植物內生細菌的揮發油成分及其抑菌活性研究報道較少。本研究運用 GC- MS 聯用技術分析并鑒定出18個成分，其中以油酸、油酸乙酯、亞麻油酸乙酯、亞油酸、棕櫚酸和棕櫚酸乙酯為主，還有一個未鑒定出的化學成分，揮發油粗提物對香蕉枯萎病菌具有很好的抑菌活性。

據相關文獻報道，檸檬酸、棕櫚酸、油酸、硬脂酸及亞油酸等有抑制細菌和真菌生長的作用。Walters等[9]的研究發現，油酸、亞油酸和亞麻酸能抑制Rhizoctonia solani、Pythium ultimum、Pyrenophora avenae 和Crinipellis perniciosa等重要植物病原真菌的生長。Liu等[10]研究發現，棕櫚酸、油酸及亞油酸等有機酸不僅對植物病原菌Alternaria solani、Colletotrichum lagenarium、Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum 和Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici的菌絲有抑制作用，還對孢子萌發有抑制作用。馬妙蓮等[11]從小米中分離到一株戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus），其代謝產物對黃曲霉、革蘭氏陽性菌、陰性菌具有較強的抑制作用，分析發現，發酵液含有棕櫚酸、油酸、硬脂酸、亞油酸、乙酸、乳酸、琥珀酸和檸檬酸等多種抑菌成分。在抑菌機制方面，Tyler等[12]研究表明，Pseudozyma flocculosa菌產生的孢外脂肪酸可嵌入菌體中，通過破壞細胞膜結構和裂解細胞，抑制植物白粉病菌的生長。有關本研究的抑菌有效成分及抑菌機理有待進一步研究。

參考文獻

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