西北太平洋柔魚角質顎微結構及其生長紋周期性研究*

劉必林 林靜遠 陳新軍① 胡貫宇

(1. 上海海洋大學海洋科學學院 上海 201306; 2. 國家遠洋漁業工程技術研究中心 上海 201306; 3. 大洋漁業資源可持續開發省部共建教育部重點實驗室 上海 201306; 4. 遠洋漁業協同創新中心 上海 201306 )

角質顎是位于頭足類口球內主切割食物功能的硬組織結構, 由上下兩片組成(劉必林等, 2009), 其主要成分為角質纖維和蛋白質(Hunt et al, 1981;Miserez et al, 2007)。作為頭足類少數硬組織之一, 角質顎因其具有結構穩定、耐腐蝕以及信息儲存良好等特點而受到國內外學者的廣泛關注(劉必林等, 2014,2015)。隨著 Clarke(1964)首先在強壯桑椹烏賊Moroteuthis ingens的角質顎中發現生長紋后, 越來越多的學者致力于利用角質顎微結構來研究頭足類的年齡和生長(Perales-Raya et al, 2010, 2014a;Oosthuizen, 2004; Canali et al, 2011; Castanhari et al,2012; Cuccu et al, 2013)。然而, 研究只集中在真蛸Octopus vulgaris (Cuccu et al, 2013; Perales-Raya et al,2014b)和瑪雅蛸 O. maya (Rodríguez-Domínguez et al,2013; Bárcenas et al, 2014)這兩種蛸類身上, 關于柔魚類僅有 Mereu等(2011)和胡貫宇等(2015)對角質顎的生長紋進行了判讀。為此, 本文以西北太平洋海域的柔魚為例, 分析柔魚類角質顎的微結構特征, 通過與耳石判定的日齡做比較以確定角質顎生長紋的日周期性, 并建立柔魚胴長、體重和角質顎喙長與日齡的關系。研究結果不僅為柔魚類年齡鑒定與生長估算提供新方法, 而且為我國頭足類學者開展相關研究提供重要基礎。

1 材料和方法

1.1 材料來源

2010年5—6月和2011年9—11月共采集柔魚樣本 35尾, 樣本實驗室解凍后小心將耳石和角質顎取出, 清洗其表面的黏液及其它有機物后, 分別保存于盛有 75%酒精的離心管和管口瓶中, 并貼好標簽以備后用。與此同時, 記錄樣本的胴長(mantle length,ML)、體重(body weight, BW)、性別、性腺成熟度等基礎生物學數據, 角質顎喙長(Upper rostrum length,URL)的測量依據劉必林等(2010)。

1.2 角質顎

取出保存于管口瓶中的角質顎上顎, 用帶有0.3 mm刀片的小型手持切割機沿角質顎喙部頂端至頭蓋后緣縱向切割成兩半(圖 1), 用剪刀將其中半個角質顎的喙部截面(Rostrum sagittal section, RSS)剪下(圖 2a); 使角質喙部切割面朝下平放于塑料模具(圖 2b)中, 倒入調配好的冷埋樹脂溶液包埋(圖 2c),然后置常溫避光處待其硬化; 硬化后的樹脂塊切割成 2—3mm 的薄片, 并用強力熱熔膠粘于載玻片上(圖 2d); 先后以 240、600、1200、2000目水磨砂紙將切片研磨至中心面, 最后以 0.05μm氧化鋁劑拋光研磨面(圖 2e、f)。

圖2 角質顎喙部切片制作流程圖Fig.2 Flow charts of upper beak RSS preparation

1.3 生長紋計數

制作好的角質顎切片在 Olympus顯微鏡100×和400×下, 采用控制攝像系統(Charged Coupled Device,CCD)分別對喙部整體和頂端的生長紋進行拍照, 然后用Photoshop 7.0圖像處理軟件對兩個倍數下所拍的圖片分別進行拼圖處理。生長紋計數時, 先對100×下采集的圖像由喙部后端向前端, 始終沿生長紋垂直的方向計數喙部背側的生長紋數目, 直至喙部背側邊緣處, 再對 400×下采集的圖像繼續計數, 邊緣空白處的生長紋數目由臨近的生長紋寬度推算而得。每個樣本分別獨立計數 3次, 采用變異系數(Coefficient of variation, CV)檢驗計數的準確性, 其計算公式如下

式中 R1、R2、R3分別代表每個樣本獨立的 3次計數值, R代表3次計數的平均值。

1.4 耳石日齡鑒定

每個角質顎對應的耳石樣本, 依據 Dawe等(1991)的方法對其進行包埋、切割、研磨、拋光、觀察、計數等。根據柔魚類耳石生長紋“一日一齡”的理論, 柔魚耳石的生長紋個數即其實際日齡。

1.5 角質顎生長紋日周期性驗證

采用獨立樣本配對t檢驗檢查角質顎生長紋與日齡是否存在顯著差異, 同時對角質顎生長紋數目與耳石日齡進行線性回歸分析, 并比較擬合線性方程的斜率和相關系數是否接近1。

1.6 建立生長方程

采用線性、冪函數、指數、對數、邏輯斯蒂、von Bertalanffy和Gompertz等7個生長模型來擬合柔魚體長、體重和角質顎喙部的生長, 其中赤池信息準則(Akaike information criterion , AIC)值最小的為最適生長模型(Arkhipkin et al, 2000)。AIC計算公式如下

式中k為模型的參數數量, n為樣本數量, RSS為剩余平方和。

2 結果

2.1 角質顎微結構

角質顎上顎喙部截面由背側的頭蓋和腹側的脊突兩部分組成(圖 1c), 周期性的生長帶明顯, 每一條生長帶由明、暗兩條生長紋組成。頭蓋部的生長紋明顯比脊突部的生長紋清晰, 兩部分的生長紋交匯于內軸成“＜”形, 生長紋后端逐漸平行于脊突背緣(圖1c, 圖 2)。角質顎的喙部頂端以及后端常有明顯的標記輪(圖3a, b)。截面中部的生長紋最寬(圖3c), 頂端生長紋最窄(圖 3d), 而同一條生長紋越接近內軸的部分其寬度越寬(圖 3e), 越遠離內軸的部分其寬度越窄(圖 3f)。柔魚角質顎喙部生長紋的平均寬度為 12.4 μm。

圖3 柔魚角質顎上顎喙部微結構圖Fig.3 Light microstructure of upper beak RSS

2.2 角質顎生長紋數目與耳石日齡關系

分析結果顯示, 三次獨立計數 CV值為 2.97%±1.11%, 明顯小于 5%, 因此角質顎生長紋計數準確,每個角質顎生長紋的形成需要1.018±0.039天。獨立樣本配對t檢驗顯示, 角質顎喙部生長紋數目與耳石日齡無明顯差異(P=0.057＞0.05)。擬合線性方程顯示,斜率(1.0177)和相關系數R2(0.9693)均接近于1(圖4)。耳石估算日齡為 112—270 天, 角質顎估算日齡為102—266 天, 兩者基本相當, 因此, 柔魚角質顎生長紋的沉積為“一日一紋”。

2.3 角質顎日齡與柔魚胴長和體重關系

根據最小AIC法(表1), 柔魚胴長和體重與角質顎日齡關系均適合用邏輯斯蒂曲線來描述, 日齡 200天以前柔魚胴長和體重增長較快, 200天以后增長變緩(圖 5), 其關系式分別如下, 其中 ML為胴長, BW為體重, A為日齡。

圖4 柔魚角質顎上顎喙部生長紋數目與耳石日齡的關系Fig.4 Relationship between number of growth increments of upper beak rostrum sagittal section and statolith determined age for O. batramii

表1 線性、冪函數、指數、對數、邏輯斯蒂、von Bertalanffy和Gompertz等7個生長方程擬合柔魚胴長-日齡、體重-日齡上顎喙長-日齡參數值Tab.1 Parameters of linear, power, exponential, logarithmic,logistic, von Bertalanffy and Gompertz models fitted to ML-age, BW-age and URL-age data for O. batramii.

2.4 角質顎日齡與喙長關系

根據最小AIC法(表1), 柔魚角質顎喙長與日齡適合用邏輯斯蒂曲線來描述, 日齡200天以前角質顎喙部生長較快, 200天以后生長變緩(圖6), 其關系式如下, 其中URL表示角質顎喙長,A為日齡：

3 討論

圖5 柔魚胴長、體重與角質顎日齡關系Fig.5 Correlations of ML and BW to the increment-determined age for O. bartramii

圖6 角質顎上顎喙長與日齡關系Fig.6 Relationship between URL and increment determined age for O. bartrami

頭足類的角質顎與其耳石、內殼、眼晶體等硬組織一樣, 存在明顯的生長紋結構, 角質顎頭蓋、脊突、側壁、翼部等各部表面的生長紋明顯, 肉眼可見, 而喙部的生長紋則須要切割研磨后才可見(劉必林等,2014)。Clarke(1964)首次詳細報道了強壯桑椹烏賊角質顎中的生長紋結構, Nixon(1973)和Smale等(1993)先后在其它頭足類角質顎中也發現了類似的結構。然而截至目前, 有關頭足類角質顎生長紋的研究主要集中在側壁和喙部兩個部位, 側壁生長紋是以喙頂端為中心的同心環紋(Perales-Rayaet al, 1998), 而喙部生長紋則是以內軸為對稱軸的“＜”形條紋(圖 1c)。本研究發現, 與真蛸相似, 柔魚角質顎喙部頂端生長紋最窄(圖 3d), 中部的生長紋最寬(圖 3c) (Perales-Rayaet al, 2010)。此外, 在一些柔魚角質顎樣本的喙部頂端和后端發現了明顯的標記紋, 以往的研究認為它們的形成與頭足類特殊的生活史事件(如孵化、交配、產卵)以及突發事件(溫度波動、捕食者攻擊)等密切相關(Arkhipkin, 2005; Perales-Raya et al, 2014b)。

Perales-Raya等(1998)首先提出真蛸角質顎生長紋的形成可能與其年齡相關, 直到 2001年Hernández-López才從實驗角度證實了幼體真蛸角質顎側壁生長紋具有日周期性。在此之后, Oosthuizen(2004)、Canali 等(2011)、Rodríguez-Domínguez 等(2013)、Bárcenas等(2014)和 Perales-Raya 等(2014)先后采用四環素標記、溫度突變標記、實驗室飼養法驗證了真蛸和瑪雅蛸角質顎喙部生長紋的日周期性。酒井光夫等(2007)嘗試分析 5種柔魚類(莖柔魚 D.gigas、柔魚、阿根廷滑柔魚Illex. argentinus、鳶烏賊thenotheuthis oualaniensis和太平洋褶柔魚Todarodes pacificus)仔魚角質顎生長紋的周期性, 結果表明, 除鳶烏賊外, 其余 4種角質顎的生長紋均為“一日一紋”。然而, 本文首次驗證了柔魚類整個生命史周期內角質顎生長紋的日周期性, 彌補了前者只限于仔魚期的不足。

研究表明, 在利用硬組織鑒定頭足類的日齡時,弄清第1條生長紋形成的時間至關重要： 當其形成于頭足類孵化時, 則估算的日齡與實際日齡相等; 而當其形成于孵化前, 則估算的日齡比實際日齡大, 反之則比實際日齡小(劉必林等, 2009, 2014)。此外, 計數者的經驗也是影響日齡鑒定準確性的關鍵, 計數結果的可重復性可用作檢驗準確性的標準。一般來說,在年齡鑒定研究中, 生長紋計數的可信臨界標準為,獨立重復計數 2—3次, 幾次計數值的差異不高于10%(Jackson et al, 1997; Oosthuizen, 2004)。本文 3次獨立計數值的差異為 2.97 %±1.11%, 明顯小于10%,加之已有研究證明柔魚角質顎的第 1生長紋形成于孵化時(酒井光夫等, 2007)。因此, 本文通過角質顎喙部估算的柔魚日齡是準確的, 其結果顯示柔魚壽命小于1年, 這與耳石估算的柔魚壽命相符(Yatsu et al,1997)。最小 AIC法顯示, 柔魚胴長、體重以及角質顎喙長與日齡呈顯著的邏輯斯蒂關系, 這說明柔魚在其幼體期胴長、體重以及喙長生長較快, 而隨著性腺不斷成熟生長逐步變緩, 這符合頭足類的一般生長規律(Arkhipkin, 2005)。

4 結論

過去幾十年, 盡管耳石微結構分析被認為是研究頭足類年齡和生長的最有效方法(Jackson, 1994),然而近年來, 頭足類研究者們仍在不斷嘗試尋找另外一些可靠的途徑(如內殼、角質顎、眼晶體微結構分析)來代替耳石(Doubleday et al, 2011; Cárdenas et al, 2011; Perales-Raya et al, 2014b)。對于蛸類而言,其耳石晶體結構紊亂導致生長紋不清晰, 因而角質顎微結構分析逐步成為其年齡和生長研究的最有效方法之一(Perales-Raya et al, 1998, 2010, 2014a;Hernández-López et al, 2001; Oosthuizen, 2004; Canali et al, 2011; Castanhari et al, 2012; Cuccu et al, 2013)。角質顎個體比耳石大許多, 更容易提取、更方便研磨,而且具有結構穩定、耐腐蝕的特點, 常存于大型魚類、海鳥以及哺乳動物的胃內(Boyle et al, 2005), 更易間接獲取, 因此角質顎的這些特點使其在頭足類的年齡和生長中的研究前景更為廣闊。然而, 有一點需要注意的是, 頭足類的捕食活動常常會造成角質顎喙頂端一定程度的磨損。因此, 建議在利用角質顎喙部鑒定頭足類日齡時, 需要選擇那些角質顎磨損較小的樣本, 以免過度低估實驗樣本的實際日齡。

劉必林, 陳新軍, 2009. 頭足類角質顎的研究進展. 水產學報,33(1)： 157—164

劉必林, 陳新軍, 2010. 印度洋西北海域鳶烏賊角質顎長度分析. 漁業科學進展, 31(1)： 8—14

劉必林, 陳新軍, 方 舟等, 2014. 利用角質顎研究頭足類的年齡與生長. 上海海洋大學學報, 23(6)： 930—936

劉必林, 陳新軍, 方 舟等, 2015. 基于角質顎長度的頭足類種類判別. 海洋與湖沼, 46(6)： 1365—1372

胡貫宇, 陳新軍, 劉必林等, 2015. 莖柔魚耳石和角質顎微結構及輪紋判讀. 水產學報, 39(3)： 361—370

酒井光夫, Brunetti N, Bower J et al, 2007. アカイカ科稚仔5種Illex argentinus, Todarodes pacificus, Dosidicus gigas,Ommastrephes bartramii, Sthenoteuthis oualaniensis におけ る 上 顎 板 輪 輪 の 日 齢 形 質 . イ カ 類 類 源 研究會 議 , 9：1—7 (in Japanese with English abstract)

Arkhipkin A I, 2005. Statoliths as ‘black boxes’ (life recorders) in squid. Marine and Freshwater Research, 56(5)： 573—583

Arkhipkin A I, Jereb P, Ragonese S, 2000. Growth and maturation in two successive seasonal groups of the short-finned squid,Illex coindetii from the Strait of Sicily (central Mediterranean). ICES Journal of Marine Science, 57(1)：31—41

Bárcenas G V, Perales-Raya C, Bartolomé A et al, 2014. Age validation in Octopus maya (Voss and Solís, 1966) by counting increments in the beak rostrum sagittal sections of known age individuals. Fisheries Research, 152： 93—97

Boyle P, Rodhouse P, 2005. Cephalopods： Ecology and Fisheries.Oxford： Blackwell Science Ltd, 234—258

Cárdenas E R B, Correa S M, Guzman R C et al, 2011. Eye lens structure of the octopus Enteroctopus megalocyathus：evidence of growth. Journal of Shellfish Research, 30(2)：199—204

Canali E, Ponte G, Belcari P et al, 2011. Evaluating age in Octopus vulgaris： estimation, validation and seasonal differences. Marine Ecology Progress Series, 441： 141—149

Castanhari G, Tomás A R G, 2012. Beak increment counts as a tool for growth studies of the common octopus Octopus vulgaris in Southern Brazil. Boletim do Instituto de Pesca,S?o Paulo, 38(4)： 323—331

Clarke M R, 1964. “Growth Rings” in the beaks of the squid Moroteuthis ingens (Oegopsida： Onychoteuthidae).Malacologia, 3(2)： 287—307

Cuccu D, Mereu M, Cau A et al, 2013. Reproductive development versus estimated age and size in a wild Mediterranean population of Octopus vulgaris (Cephalopoda：Octopodidae). Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom, 93(3)： 843—849

Dawe E G, Natsukari Y, 1991. Light microscopy. In： Jereb P,Ragonese S, Boletzky S V eds. Squid age determination using statoliths. Proceedings of the International Workshop,9—14 October 1989, Istituto di Tecnologia della Pesca e del Pescato, N.T.R.-I.T.P.P. Mazara del Vallo, Sicily, Italy.Special Publication No. 1： 83—95

Doubleday Z A, White J, Pecl G T et al, 2011. Age determination in merobenthic octopuses using stylet increment analysis：assessing future challenges using Macroctopus maorum as a model. ICES Journal of Marine Science, 68(10)：2059—2063

Hernández-López J L, Castro-Hernández J L, Hernández-García V, 2001. Age determined from the daily deposition of concentric rings on common octopus (Octopus vulgaris)beaks. Fishery Bulletin, 99(4)： 679—684

Hunt S, Nixon M, 1981. A comparative study of protein composition in the chitin-protein complexes of the beak, pen,sucker disc, radula and oesophageal cuticle of cephalopods.Comparative Biochemistry and Physiology Part B：Comparative Biochemistry, 68(4)： 535—546

Jackson G D, 1994. Application and future potential of statolith increment analysis in squids and sepioids. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 51(11)： 2612—2625

Jackson G D, Forsythe J W, Hixon R F et al, 1997. Age, growth,and maturation of Lolliguncula brevis (Cephalopoda：Loliginidae) in the northwestern Gulf of Mexico with a comparison of length-frequency versus statolith age analysis.Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 54(12)：2907—2919

Mereu M, Stacca D, Cannas R et al, 2011. On the growth rings on Histioteuthis bonnellii (Férussac, 1835) upper beaks.Biologia Marina Mediterranea, 18(1)： 124—127

Miserez A, Li Y L, Waite J H et al, 2007. Jumbo squid beaks：inspiration for design of robust organic composites. Acta Biomaterialia, 3(1)： 139—149

Nixon M, 1973. Beak and radula growth in Octopus vulgaris.Journal of Zoology (London), 170(4)： 451—462

Oosthuizen A, 2004. A development and management framework for a new Octopus vulgaris fishery in South Africa. South Africa： Doctor Dissertation of Rhodes University, 183

Perales-Raya C, Bartolomé A, García-Santamaría M T et al, 2010.Age estimation obtained from analysis of octopus (Octopus vulgaris Cuvier, 1797) beaks： improvements and comparisons. Fisheries Research, 106(2)： 171—176

Perales-Raya C, Almansa E, Bartolomé A et al, 2014a. Age validation in Octopus vulgaris beaks across the full ontogenetic range： beaks as recorders of life events in octopuses. Journal of Shellfish Research, 33(2)： 481—493

Perales-Raya C, Jurado-Ruzafa A, Bartolomé A et al, 2014b. Age of spent Octopus vulgaris and stress mark analysis using beaks of wild individuals. Hydrobiologia, 725(1)： 105—114 Perales-Raya C, Hernández-González C L, 1998. Growth lines within the beak microstructure of the octopus Octopus vulgaris Cuvier, 1797. South African Journal of Marine Science, 20(1)： 135—142

Rodríguez-Domínguez A, Rosas C, Méndez-Loeza I et al, 2013.Validation of growth increments in stylets, beaks and lenses as ageing tools in Octopus maya. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 449： 194—199

Smale M J, Clarke M R, Klages N T W et al, 1993. Octopod beak identification-resolution at a regional level (Cephalopoda,Octopoda： Southern Africa). South African Journal of Marine Science, 13(1)： 269—293

Yatsu A, Midorikawa S, Shimada T et al, 1997. Age and growth of the neon flying squid, Ommastrephes bartrami, in the North Pacific Ocean. Fisheries Research, 29(3)： 257—270