石墨烯類材料在組織工程中的應用

鄒亞光　魏皎　綜述　李青峰　審校

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石墨烯類材料在組織工程中的應用

鄒亞光魏皎綜述李青峰審校

【提要】石墨烯是一種具有獨特理化性質的二維晶體納米材料，在各個領域中都有廣泛應用，但在再生醫學方面的研究尚處于早期階段。我們就石墨烯類材料的細胞毒性，及其誘導干細胞向成骨、成神經、成心肌、成脂方向分化的相關研究進行綜述。

【關鍵詞】石墨烯細胞毒性分化

作者單位：200011上海市上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院整復外科。

Application of Graphene-based Materials in Tissue Engineering

ZOU Yaguang,WEI Jiao,LI Qingfeng.

Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200011,China.Corresponding author:LI Qingfeng(E-mail:dr.liqingfeng@yahoo.com).

【Summary】Graphene is a kind of atomic crystal nanomaterial arranged in a two-dimensional structure with extraordinary physicochemical properties,which have been extensively employed in various fields.However the application of graphene in regenerative medicine is still in an early phase.In this paper,the study of toxicity of graphene-based materials and its ability of inducing stem cell differentiation into osteogenic,neuronal,cardiomyogenic and adipogenic lineages were reviewed.

【Key words】Graphene;Cell toxicity;Differentiation

碳元素作為地球上最常見的元素之一，是生物體內化學反應過程中不可缺少的一部分。由于碳原子之間的共價鍵存在多種軌道雜化方式（sp，sp2，sp3），碳元素擁有為數眾多的同素異形體，如金剛石、石墨、足球烯等。2004年，Novoselo和Geim成功地通過實驗從石墨中分離出石墨烯，并證實其可以單獨存在[1]。此后，石墨烯類材料就以其獨特的理化特性成為各領域研究的焦點[2-3]。

石墨烯是一種二維平面多環芳香烴原子晶體，碳原子以sp2雜化軌道形成蜂巢晶格，保持著嚴格的二維結構且非常穩定[4]。通過不同小分子基團的化學修飾，石墨烯的分子結構可發生改變并形成多種衍生物，常見的石墨烯類材料包括氧化石墨烯（GO）、還原氧化石墨烯（r-GO）、多層石墨烯、超薄石墨、碳納米管（CNT）、石墨烯納米片（GNS）等，這些性質各異的材料共同構成了龐大的石墨烯納米材料家族（GNFs）[5-7]。同時，石墨烯類材料還能與生物相容聚合物材料結合，形成更為復雜的多功能的復合物。

石墨烯是最薄、最堅硬的納米材料，其光學性質、導熱性能、導電能力均非常優秀[1，8-12]，廣泛應用于納米生物傳感器[13]、太陽能電池、近紅外標記探針、光敏劑等不同領域[14-15]；而石墨烯的高比表面積[16]及疏水性帶來的對各類藥物分子的吸附性，使其在藥物的靶向運輸上也擁有巨大的潛力[17-19]。

盡管石墨烯類材料在工業、微電子等領域中已經得到了廣泛的應用，但其在醫學，尤其是再生醫學中的研究，依然處在相當早期的階段。我們就石墨烯及其衍生物近年來在組織工程領域的研究進展進行綜述。

1　石墨烯類材料的毒性研究

當石墨烯及其衍生物被應用于生物領域時，其生物毒性一直是研究的焦點，但由于并不存在一個特征性的參數來衡量納米材料的細胞毒性，因此需要從體內外等多方面來進行衡量。大量的研究表明，單純的石墨烯能夠引起細胞的氧化應激與炎癥反應，存在一定的細胞毒性[20-21]。

在Zhang等[22]的體外研究中，石墨烯與單壁碳納米管以0.1～100 μg/mL的不同濃度來測試對嗜鉻神經細胞瘤細胞系PC12的影響。兩種材料均表現出了與濃度相關的細胞毒性。而石墨烯對細胞產生了更強的氧化應激反應，介導Caspase-3活化，導致細胞凋亡。結果表明，天然石墨烯的體外生物毒性存在一定的形狀相關性與濃度依賴性。而Chauhan等[23]的研究也表明，直徑＞5 nm的石墨烯材料容易在體內堵塞毛細血管，引發炎癥反應，而相對直徑較小的材料則容易被腎臟排泄。

Sasidharan等[24]測試了不同濃度的氧化石墨烯與羧基化的氧化石墨烯在猴腎細胞中的毒性作用。結果表明，氧化石墨烯會積聚在細胞膜表面，破壞F-actin蛋白的穩定性，造成濃度依賴性的氧化應激，影響細胞骨架的形態，最終導致細胞凋亡；而羧基化的氧化石墨烯在任何濃度下均未表現出明顯的細胞毒性。其他相似的研究也證實了氧化石墨烯雖然毒性小于石墨烯，但在一定濃度下也會造成細胞的氧化應激與蛋白質、DNA的損傷和細胞凋亡，而通過更多適當的含氧基團的修飾，可以削弱石墨烯疏水鍵與細胞間的相互作用，降低其毒性[19，25-28]。另外，同屬石墨烯材料家族的還原氧化石墨烯，在體外實驗中也導致細胞活力顯著降低，表現出明顯的細胞毒性[29]。

進一步研究表明，石墨烯類材料通過表面修飾和功能化能夠降低生物毒性，增加生物相容性，甚至促進細胞增殖。Liao等[30]報道了使用殼聚糖被覆的氧化石墨烯成功解決了普通氧化石墨烯帶來的溶血副作用。Yang等[14，31-32]介紹了聚乙二醇（PEG）偶聯的石墨烯類材料（包括石墨烯與氧化石墨烯）在生物體內毒性的改善，包括體外毒性的降低，體內在網狀內皮系統內潴留較少，腫瘤細胞內積聚增多，對血液系統、消化系統沒有明顯的毒副作用等。同時，他們也報道了葡聚糖（Dextran）功能化的氧化石墨烯能夠顯著增加細胞的體外活性，促進細胞的增殖，并在體內增加肝臟與脾臟對材料的吸收與代謝，減少其短期毒性[33]。

綜上所述，盡管石墨烯類材料存在有一定的體外毒性，材料本身的形狀、大小、濃度，以及培養細胞的種類、狀態均會對其毒性造成影響，但通過一定程度的化學修飾及高分子材料的功能化能夠有效地降低材料本身的毒性，改善生物相容性，并促進其在生物體內的靶向、分解與代謝。因此，在生物醫學領域，功能化的石墨烯材料是一種安全的選擇。

2　石墨烯類材料與細胞分化的研究

因具有高生物兼容性，低毒性，高比表面積，對各類小分子物質較強的吸附能力等物理化學性質，石墨烯類材料在組織工程領域有著良好的應用前景。目前的研究主要包括①將石墨烯類納米材料溶解于干細胞培養液中，檢測其對干細胞體外分化的影響；②將石墨烯類材料單獨或與高分子材料進行偶聯，制成生物支架，研究干細胞在其表面的黏附、增殖、分化[34-35]。目前已有大量的研究表明，石墨烯類材料能夠促進干細胞多向分化。

2.1成骨方向研究

骨組織工程一直致力于研究不同材料誘導干細胞向成骨方向分化，以填補因嚴重損傷或先天性殘疾等因素造成的骨缺損。研究表明，石墨烯類材料能顯著增強現有支架材料的生物相容性，并促進干細胞的黏附、增殖及分化[36]。

Kalbacova等[37]將石墨烯被覆于二氧化硅材料表面，并在其上種植成骨細胞與hBMSC。培養48 h后，被覆組材料上的細胞相比對照組具有更強的黏附性和增殖能力。Nayak等[38-39]則先后使用聚乙二醇偶聯的碳納米管與石墨烯被覆的PET、PDMS、Si/SiO2等材料來檢測不同硬度的基底材料上石墨烯類材料對BMSCs成骨分化能力的影響。結果表明，實驗組BMSCs出現了顯著的成骨細胞標志物降鈣素（OCN）的表達，而對照組中的細胞則依舊CD44陽性表達（BMSC的特征性標志）；在茜素紅染色中，實驗組也出現了更多的鈣沉積。證明了石墨烯材料是促進干細胞成骨分化的重要因素，與基底材料的種類沒有明顯的相關性。

Pan等[40]發現，種植于碳納米管復合支架上的BMSCs使用普通干細胞培養液（不含誘導因子），也能誘導分化成骨，并高表達堿性磷酸酶，認為可能與材料在空間上的形態有一定的關系。Crowder等[41]的研究表明，三維泡沫狀結構的石墨烯材料同樣能夠誘導hBMSCs向成骨方向分化。研究發現，氧化石墨烯材料能夠促進hBMSCs成骨方向分化[42]。種植于氧化石墨烯被覆鈦金屬材料表面的hBMSCs在2～3周后出現了更顯著的骨形態發生蛋白（BMP-2）的表達。

2.2神經方向研究

目前，自體神經移植仍然是神經損傷修復的首選方案，然而，供區的缺乏與移植后供區神經功能的缺損一直是無法解決的問題[43]。因此，構建組織工程化神經以供移植，被視為最佳的替代方案[44]。相關研究中，常以神經干細胞或胚胎干細胞作為種子細胞，并以一定的電刺激作為誘導分化的條件。石墨烯類材料以其優異的電學特性和對干細胞良好的生物相容性被廣泛地應用[45]。

相關研究表明，石墨烯被覆的材料相比對照組更能促進NSCs或神經細胞瘤細胞PC-12的黏附與增殖，并促進其向神經元細胞方向分化[46-47]。氧化石墨烯與還原氧化石墨烯被覆的材料能在一定條件刺激下（電刺激、光刺激）促進ESCs 與NSCs分化為神經元細胞，并抑制其向神經膠質細胞的分化[48-49]。

Li等[50]發現，三維結構的石墨烯支架更能促進神經干細胞的黏附，并能通過更好的導電性傳遞電刺激促使干細胞向神經元細胞分化。Wang等[51]的研究則表明，氟化的石墨烯材料相較于傳統的純石墨烯，能更為顯著地促進MSCs向神經細胞方向分化。而Chao等[52]的研究也表明，碳納米管與聚丙烯酸復合材料能夠很好地消除原有聚丙烯酸對神經分化的不良影響，并促進ESCs神經方向的分化[53]。

2.3心肌方向研究

石墨烯類材料良好的導電性同樣被應用于促進心肌細胞增殖與干細胞向心肌方向分化的生物支架材料中。碳納米管的納米幾何結構與人心臟組織細胞外基質結構非常相似，Stout等[54]將碳納米管與聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）材料相結合，探究復合支架與心肌細胞的相互影響。研究表明，結合了碳納米管的支架上，心肌細胞的密度接近對照組的5倍。Mooney等[55]則將hMSCs種植于碳納米管與聚乳酸材料（PLA）的復合支架上，經一定的電刺激，發現hMSCs顯著表現出向心肌前體細胞分化的趨勢，其心肌相關蛋白Nkx2.5、GATA-4、心肌肌鈣蛋白T與心肌縫隙連接蛋白43明顯上調。

不僅僅局限于碳納米管，Lee等[56]也報道了玻璃黏連蛋白（VN）被覆的石墨烯材料能夠促使種植其上的ESCs中與內胚層、中胚層分化相關的基因表達逐步上調，并隨后向心肌方向分化。研究認為，這一分化過程與石墨烯促進培養環境中細胞外基質蛋白與信號分子表達上調有關[57]。

2.4成脂方向研究

Lee等[58]將hMSCs種植在覆有石墨烯與氧化石墨烯的聚二甲基硅氧烷（PDMS）材料表面，經14 d的成脂誘導后，油紅染色顯示氧化石墨烯材料組能夠顯著地促進hMSCs成脂方向的分化，說明氧化石墨烯能夠濃縮成脂誘導液的成分，是有效促進分化的平臺。然而石墨烯材料組卻明顯抑制了其分化，可能與石墨烯促使胰島素變性有關。另有類似研究顯示，氧化石墨烯能夠促進hADSCs在材料表面的黏附與增殖，同時也顯著提高了hADSCs向成骨、上皮方向的分化能力，并抑制其向成軟骨方向分化[34]。

近年來，石墨烯類材料在組織工程領域的研究中，體內與體外的實驗均證實其能促進組織的修復與重建，甚至已有一部分臨床試驗獲得開展。但是該材料對細胞的潛在毒性不容忽視，眾多因素均對其毒性的評估有著至關重要的影響。只有盡早地建立相關材料的加工流程規范與精確的生物相容性評估系統，才能使石墨烯類材料擺脫安全性的爭議。

雖有大量的研究表明石墨烯與其衍生物氧化石墨烯等材料能顯著促進干細胞黏附、增殖，并向各個方向分化，但其確切的機制仍不明確。目前的研究認為，石墨烯類材料以其獨特的納米微觀結構（如不同形態材料表面對細胞的張力）、高比表面積，以及強大的吸附能力，使大量生長因子、蛋白質等營養物質能聚集、濃縮其表面，作為一種干細胞巢，影響細胞分子信號通路的表達，從而誘導干細胞的分化。而外源性協同的電與光學的刺激，及復合材料帶來的特性，也能很大程度影響石墨烯對干細胞分化的作用。進一步深入研究石墨烯與干細胞間的相互作用，將對石墨烯類材料在組織工程領域中的應用提供更堅實的理論基礎。

盡管石墨烯在醫學方面的研究仍處于早期階段，但憑借其優異的理化特性和良好的生物相容性，石墨烯類材料在組織工程領域有著極大的應用前景，有望為先天性或嚴重損傷造成的組織缺損帶來新的解決方案。

參考文獻

[1]Novoselov KS,Geim AK,Morozov SV,et al.Electric field effect in atomically thin carbon films[J].Science,2004,306(5696):666-669.

[2]Geim AK,Novoselov KS.The rise of graphene[J].Nat Mater, 2007,6(3):183-191.

[3]Geim AK.Random walk to graphene(Nobel Lecture)[J].Angew Chem Int Ed,2011,50(31):6966-6985.

[4]Stankovich S,Dikin DA,Dommett GHB,et al.Graphene based composite materials[J].Nature,2006,442(7100):282-286.

[5]Jastrzebska AM,Kurtycz P,Olszyna AR.Recent advances in graphene family materials toxicity investigations[J].J Nanopart Res,2012,14(12):149-158.

[6]Kim KS,Zhao Y,Jang H,et al.Large-scale pattern growth of graphene films for stretchable transparent electrodes[J].Nature, 2009,457(7230):706-710.

[7]Sanchez VC,Jachak A,Hurt RH,et al.Biological interactions of graphene-family nanomaterials:an interdisciplinary review[J]. Chem Res Toxicol,2012,25(1):15-34.

[8]Meyer JC,Geim AK,Katsnelson MI,et al.The structure of suspended graphene sheets[J].Nature,2007,446(7131):60-63.

[9]Mueller T,Xia F,Avouris P.Graphene photodetectors for highspeed optical communications[J].Nat Photonics,2010,4(5):297-301.

[10]Balandin AA,Ghosh S,Bao W,et al.Superior thermal conductivity of single-layer graphene[J].Nano Lett,2008,8(3):902-907.

[11]Palacios T.Graphene electronics:thinking outside the silicon box [J].Nat Nanotechnol,2011,6(8):464-465.

[12]Service RF.Carbon sheets an atomthick give rise to graphene dreams[J].Science,2009,324(5929):875-877.

[13]Pumera M.Graphene in biosensing[J].Mater Today,2011,14(7): 308-315.

[14]Yang K,Zhang S,Zhang GX,et al.Graphene in mice:ultrahigh in vivo tumor uptake and efficient photothermal therapy[J].Nano Lett,2010,10(9):3318-3323.

[15]Robinson JT,Tabakman SM,Liang YY,et al.Ultrasmall reduced graphene oxide with high near-infrared absorbance for photothermal therapy[J].J Am Chem Soc,2011,133(17):6825-6831.

[16]Park S,Ruoff RS.Chemical methods for the production of graphenes[J].Nat Nanotechnol,2009,4(4):217-224.

[17]Liu Z,Robinson JT,Sun XM,et al.PEGylated nanographene oxide for delivery of water-insoluble cancer drugs[J].J Am Chem Soc,2008,130(33):10876-10877.

[18]Yang XY,Zhang XY,Liu ZF,et al.High-efficiency loading and controlled release of doxorubicin hydrochloride on graphene oxide[J].J Phys Chem C,2008,112(45):17554-17558.

[19]Bao HQ,Pan YZ,Ping Y,et al.Chitosan-functionalized graphene oxide as a nano-carrier for drug and gene delivery[J].Small, 2011,7(11):1569-1578.

[20]Yang ST,Wang X,Jia G,et al.Long-term accumulation and low toxicity of single-walled carbon nanotubes in intravenously exposed mice[J].Toxicol Lett,2008,181(3):182-189.

[21]Zhang Y,Petibone D,Xu Y,et al.Toxicity and efficacy of carbon nanotubes and graphene:the utility of carbon-based nanoparticles in nanomedicine[J].Drug Metab Rev,2014,46(2):232-246.

[22]Zhang YB,Ali SF,Dervishi E,et al.Cytotoxicity effects of graphene and single-wall carbon nanotubes in neural phaeochromocytomaderived PC12 cells[J].ACS Nano,2010,4(6):3181-3186.

[23]Chauhan VP,Stylianopoulos T,Martin JD,et al.Normalization of tumour blood vessels improves the delivery of nanomedicines in a size-dependent manner[J].Nat Nanotechnol,2012,7(6):383-388.

[24]Sasidharan A,Panchakarla LS,Chandran P,et al.Differential nano-bio interactions and toxicity effects of pristine versus functionalized graphene[J].Nanoscale,2011,3(6):2461-2464.

[25]Lv M,Zhang Y,Liang L,et al.Effect of graphene oxide on undifferentiated and retinoic acid-differentiated SH-SY5Y cells line[J].Nanoscale,2012,4(13):3861-3866.

[26]Vallabani NV,Mittal S,Shukla RK,et al.Toxicity of graphene in normal human lung cells(BEAS-2B)[J].J Biomed Nanotechnol, 2011,7(1):106-107.

[27]Chowdhury SM,Lalwani G,Zhang K,et al.Cell specific cytotoxicity and uptake of graphene nanoribbons[J].Biomaterials,2013,34(1): 283-293.

[28]Hu W,Peng C,Lü M,et al.Protein corona-mediated mitigation on cytotoxicity of graphene oxide[J].ACS Nano,2011,5(5):3693-3700.

[29]Chang YL,Yang ST,Liu JH,et al.In vitro toxicity evaluation of graphene oxide on A549 cells[J].Toxicol Lett,2011,200(3):201-210.

[30]Liao KH,Lin YS,Macosko CW,et al.Cytotoxicity of graphene oxide and graphene in human erythrocytes and skin fibroblasts [J].ACS Appl Mater Interfaces,2011,3(7):2607-2615.

[31]Yang K,Wan J,Zhang S,et al.In vivo pharmacokinetics,longterm biodistribution,and toxicology of pEGylated graphene in mice[J].ACS Nano,2010,5(1):516-522.

[32]Yang K,Wan J,Zhang S,et al.The influence of surface chemistry and size of nanoscale graphene oxide on photothermal therapy of cancer using ultra-low laser power[J].Biomaterials,2012,33(7): 2206-2214.

[33]Zhang S,Yang K,Feng L,et al.In vitro and in vivo behaviors of dextran functionalized graphene[J].Carbon,2011,49(12):4040-4049.

[34]Kim J,Choi KS,Kim Y,et al.Bioactive effects of graphene oxide cell culture substratum on structure and function of human adiposederived stem cells[J].J Biomed Mater Res A,2013,101(12): 3520-3530.

[35]Mooney E,Dockery P,Greiser U,et al.Carbon nanotubes and mesenchymalstemcells:biocompatibility,proliferationand differentiation[J].Nano Lett,2008,8(8):2137-2143.

[36]Gupta A,Woods MD,Illingworth KD,et al.Single walled carbon nanotube composites for bone tissue engineering[J].J Orthop Res,2013,31(9):1374-1381.

[37]Kalbacova M,Broz A,Kong J,et al.Graphene substrates promote adherence of human osteoblasts and mesenchymal stromal cells [J].Carbon,2010,48(15):4323-4329.

[38]Nayak TR,Jian L,Phua LC,et al.Thin films of functionalized multiwalled carbon nanotubes as suitable scaffold materials for stem cells proliferation and bone formation[J].Acs Nano,2010,4 (12):7717-7725.

[39]Nayak TR,Andersen H,Makam VS,et al.Graphene for controlled and accelerated osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells[J].Acs Nano,2011,5(6):4670-4678.

[40]Pan L,Pei X,He R,et al.Multiwall carbon nanotubes/polycaprolactone composites for bone tissue engineering application[J]. Colloids Surf B Biointerfaces,2012,93(1):226-234.

[41]Crowder SW,Prasai D,Rath R,et al.Three-dimensional graphene foams promote osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells[J].Nanoscale,2013,5(10):4171-4176.

[42]La WG,Park S,Yoon HH,et al.Delivery of a therapeutic protein for bone regeneration from a substrate coated with graphene oxide [J].Small,2013,9(23):4051-4060.

[43]Yao L,de Ruiter GC,Wang H,et al.Controlling dispersion of axonal regeneration using a multichannel collagen nerve conduit [J].Biomaterials,2010,31(22):5789-5797.

[44]Saracino GA,Cigognini D,Silva D,et al.Nanomaterials design and tests for neural tissue engineering[J].Chem Soc Rev,2013, 42(1):225-262.

[45]Jan E,Kotov NA.Successful differentiation of mouse neural stem cells on layer-by-layer assembled single-walled carbon nanotube composite[J].Nano Letters,2007,7(5):1123-1128.

[46]Park SY,Park J,Sim SH,et al.Enhanced differentiation of human neural stem cells into neurons on graphene[J].Adv Mater, 2011,23(36):H263-H267.

[47]Hong SW,Lee JH,Kang SH,et al.Enhanced neural cell adhesion and neurite outgrowth on graphene-based biomimetic substrates [J].Biomed Res Int,2014,2014:212149.

[48]Yang D,Li T,Xu M,et al.Graphene oxide promotes the differentiation of mouse embryonic stem cells to dopamine neurons [J].Nanomedicine(Lond),2014,9(16):2445-2455.

[49]Akhavan O,Ghaderi E.Flash photo stimulation of human neural stem cells on graphene/TiO2 heterojunction for differentiation into neurons[J].Nanoscale,2013,5(21):10316-10326.

[50]Li N,Zhang Q,Gao S,et al.Three-dimensional graphene foam as a biocompatible and conductive scaffold for neural stem cells [J].Sci Rep,2013,3:1604.

[51]Wang Y,Lee WC,Manga KK,et al.Fluorinated graphene for promoting neuro-induction of stem cells[J].Adv Mater,2012,24 (31):4285-4290.

[52]Chao TI,Xiang S,Chen CS,et al.Carbon nanotubes promote neuron differentiation from human embryonic stem cells[J]. Biochem Biophys Res Commun,2009,384(4):426-430.

[53]Li B,Ma Y,Wang S,et al.Influence of carboxyl group density on neuron cell attachment and differentiation behavior:gradientguided neurite outgrowth[J].Biomaterials,2005,26(24):4956-4963.

[54]Stout DA,Basu B,Webster TJ.Poly(lactic-co-glycolic acid): carbon nanofiber composites for myocardial tissue engineering applications[J].Acta Biomaterialia,2011,7(8):3101-3112.

[55]Mooney E,Mackle JN,Blond DJ,et al.The electrical stimulation of carbon nanotubes to provide a cardiomimetic cue to MSCs[J]. Biomaterials,2012,33(26):6132-6139.

[56]Lee TJ,Park S,Bhang SH,et al.Graphene enhances the cardiomyogenic differentiation of human embryonic stem cells[J]. Biochem Biophys Res Commun,2014,452(1):174-180.

[57]Park J,Park S,Ryu S,et al.Graphene-regulated cardiomyogenic differentiation process of mesenchymal stem cells by enhancing the expression of extracellular matrix proteins and cell signaling molecules[J].Adv Healthc Mater,2013,3(2):176-181.

[58]Lee WC,Lim CH,Shi H,et al.Origin of enhanced stem cell growth and differentiation on graphene and graphene oxide[J]. Acs Nano,2011,5(9):7334-7341.

收稿日期：（2015年11月2日；修回日期：2015年12月20日）

通訊作者：李青峰（E-mail：dr.liqingfeng@yahoo.com）。

doi:10.3969/j.issn.1673-0364.2016.01.013

【中圖分類號】R318.08

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673－0364（2016）01－0048－04