菌落總數(shù)測定紙片法用于食品微生物檢驗(yàn)中的價值分析

謝展華

桂平市疾病預(yù)防控制中心 廣西 貴港 537200

菌落總數(shù)是指食品經(jīng)過處理﹑稀釋及傾注平板后，維持在一定需氧情況﹑營養(yǎng)條件﹑PH值﹑培養(yǎng)溫度及時間等情況下，1g被檢樣品所生長出來的細(xì)菌菌落總數(shù)[1]。而食品中菌落總數(shù)作為判定食品被細(xì)菌污染程度及衛(wèi)生質(zhì)量重要指標(biāo)，反應(yīng)食品生產(chǎn)﹑運(yùn)輸過程中是否符合衛(wèi)生要求，且對被檢測樣品做出適當(dāng)衛(wèi)生評價[2]。因此，食品菌落總數(shù)嚴(yán)重超標(biāo)時，表明其衛(wèi)生狀況達(dá)不到基本要求，而食品中營養(yǎng)成分遭受到破壞，加速食品腐敗變質(zhì)過程，食品會失去食用價值[3]。且消費(fèi)者食用了微生物超標(biāo)嚴(yán)重食品，會引起一系列消化道疾病，如細(xì)菌性腸胃炎，引起嘔吐﹑腹瀉﹑體溫升高等癥狀，造成嚴(yán)重公共衛(wèi)生事件。當(dāng)前常規(guī)菌落總數(shù)檢測作為常見措施，但操作復(fù)雜，檢測準(zhǔn)確性偏低及檢測效率偏低等問題。當(dāng)前紙片法作為一類快速檢測技術(shù)，其應(yīng)用效果顯著，且快速，被廣泛應(yīng)用于食品檢驗(yàn)中[4]。文章就紙片法應(yīng)用于食品微生物檢測中應(yīng)用情況如下分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

選取2016年5月～2016年9月市場上隨機(jī)購買餅干﹑糕點(diǎn)總計(jì)55份，55份餅干及糕點(diǎn)均為市場上隨機(jī)購買，2份質(zhì)控樣品批號（編號：19-W799﹑19-J761，由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測試評價中心提供）。平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（plate count agar，PCA）（批號190703，有效期3年，北京陸橋技術(shù)有限公司）；3M Petrifilm 菌落總數(shù)測試片（貨號 70200572157 明尼蘇達(dá)礦業(yè)制造國際貿(mào)易有限公司提供）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

平板計(jì)數(shù)法：培養(yǎng)基配置：培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌，將其放入恒水溫的浴鍋中，按照標(biāo)準(zhǔn)維持水溫在46℃。樣液制備：準(zhǔn)備好的待測樣品原液與質(zhì)控樣品10倍稀釋并充分混勻后，制備成1:10的樣品勻液。質(zhì)控樣品的制備：吸取4ml的生理鹽水水化西林，徹底溶解后，及時移除溶液，并反復(fù)對容器內(nèi)內(nèi)壁清洗，回收的清洗液為質(zhì)控樣品。選擇微量移液器對其進(jìn)行吸取，9ml的稀釋液并吸取1ml的樣品勻液，混合制備成1:100分樣品勻液。并采取平板計(jì)數(shù)法測定食品微生物菌落總數(shù)，檢測過程中維持環(huán)境無菌性，主要步驟：選擇1ml滅菌吸管吸取菌液稀釋液，將其放置于平皿內(nèi)，加入1ml無菌生理鹽水并注入平板計(jì)數(shù)瓊脂，將其搖勻后靜置冷卻﹑凝固，平板翻轉(zhuǎn)，維持在36℃±1℃的溫度下靜置培養(yǎng)48h±2h。紙片法：制備培養(yǎng)基和樣液，與平板計(jì)數(shù)法一致，制備培養(yǎng)基時，靜置測試紙片，直至恢復(fù)常溫，制備樣液時與平板計(jì)數(shù)法相同，故不作贅述。紙片法對食品微生物菌落總數(shù)檢測主要步驟：使用1ml滅菌吸管吸取菌液稀釋液，放置于測試紙片上并覆蓋，以同樣條件對其進(jìn)行培養(yǎng)。

計(jì)算方法：質(zhì)控樣品的測試結(jié)果采用“Z-比分?jǐn)?shù)”評價, Z-比分?jǐn)?shù)計(jì)算如下：Z=x -X/δ，x表示測試人員所提交的測試結(jié)果；X表示指定值；δ表示標(biāo)準(zhǔn)差。當(dāng)|Z|≤2，測試結(jié)果滿意；當(dāng) 2<|Z|<3，測試結(jié)果有問題（可疑）；當(dāng)|Z|≥3，測試結(jié)果不滿意（離群）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 平板計(jì)數(shù)法﹑試紙法對餅干﹑糕點(diǎn)平均菌落數(shù)對比情況

平板計(jì)數(shù)法﹑試紙法在餅干﹑糕點(diǎn)中平板平均菌落數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 平板計(jì)數(shù)法、試紙法對餅干、糕點(diǎn)平均菌落數(shù)對比情況

2.2 兩種方法檢測結(jié)果中不同菌落數(shù)區(qū)間的比較分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，餅干樣品組﹑糕點(diǎn)樣品組3種不同菌落數(shù)區(qū)間中，傾注法與紙片法檢測菌落總數(shù)結(jié)果無顯著差異（P＞0.05），見表2。

表2 兩種方法檢測結(jié)果中不同菌落數(shù)區(qū)間的比較分析

3 討論

食品當(dāng)被微生物污染往往為不可避免的。目前污染食品微生物主要為細(xì)菌。評價食品衛(wèi)生質(zhì)量狀況多采取微生物檢驗(yàn)中3項(xiàng)細(xì)菌指標(biāo)，包括菌落總數(shù)﹑大腸菌落及致病菌，甚至對部分特定食品中存在著特定指標(biāo)[5]。當(dāng)前測定菌落總數(shù)其目的為了解食品生產(chǎn)中從原料加工到成品包裝受到外界污染情況，經(jīng)過上述方法可觀察細(xì)菌在食品中繁殖動態(tài)，確定食品保存期，以便于對被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評價時提供合理依據(jù)。菌落總數(shù)是指被檢樣品中細(xì)菌和培養(yǎng)基混合后，每個細(xì)菌均形成一個可見的單獨(dú)菌落的假定為基礎(chǔ)[6]。檢驗(yàn)過程中，處于有氧條件下培養(yǎng)，因而并不能測出每克或每ml中檢樣中實(shí)際的總活菌屬。當(dāng)前傳統(tǒng)方式應(yīng)用于菌落總數(shù)測定中有一定局限性。一方面，厭氧菌﹑微嗜氧菌和冷營菌在此條件下不生長，另一方面，對部分特殊營養(yǎng)要求的一些細(xì)菌均受到限制，所得出結(jié)果僅包括培養(yǎng)基中發(fā)育﹑嗜中溫﹑需氧和兼性厭氧的細(xì)菌菌落總數(shù)，并不能代表樣品中實(shí)際存在所有細(xì)菌總數(shù)。

目前，食品中菌落總數(shù)測定中，樣品按照GB 4789.2-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》進(jìn)行處理，平板計(jì)數(shù)法一般將樣品制成幾個不同的10倍遞增稀釋液，后從每個稀釋液中分別取出1ml置于無菌平皿中與營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混合，當(dāng)處于一定溫度﹑一定時間后，通過對每個平皿中形成菌落數(shù)量加以依據(jù)，并依據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算出1g原始樣品中所含有細(xì)菌菌落總數(shù)[7]。但上述操作方式中，操作復(fù)雜性較高，且前期準(zhǔn)備﹑后期清洗消毒工作量大，當(dāng)處于檢測任務(wù)大﹑檢測批次較多情況時，極易出現(xiàn)交叉污染，降低檢測結(jié)果準(zhǔn)確度，且檢測效率偏低。伴隨著近些年來我國生物技術(shù)不斷發(fā)展，多種即用型菌落總數(shù)測試培養(yǎng)基不斷開發(fā)，可有效對前期工作準(zhǔn)備簡化，且后期清洗消毒工作相對減少，目前被廣泛用于食品檢測領(lǐng)域中[8]。紙片法優(yōu)點(diǎn)為開展食品微生物菌落總數(shù)檢測過程中減少培養(yǎng)基配置﹑瓊脂的高壓滅菌等繁瑣步驟，極大程度節(jié)省了人力物力，檢測同樣數(shù)量樣品過程中，紙片法主要是應(yīng)用薄紙片，平板計(jì)數(shù)法一個稀釋梯度則需要2個平行，檢測一個樣品菌落總數(shù)則需要多個梯度，需要用到多個平板，樣品較多時，則培養(yǎng)平板所占據(jù)體積較大，多數(shù)檢測機(jī)構(gòu)因場地受限制，不便購買更多培養(yǎng)箱滿足檢測需求。紙片法則適用于培養(yǎng)場地小﹑檢測樣品數(shù)量多的檢測機(jī)構(gòu)[9]。本文研究指出，通過在市場上隨機(jī)購買75份食物樣品餅干﹑蛋糕，并分別采取平板計(jì)數(shù)法﹑紙片法測定食品中微生物菌落總數(shù)，對測得結(jié)果分析得出，試紙法餅干﹑糕點(diǎn)對平板平均菌落數(shù)測定上無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（P＞0.05）。對兩種方法檢測結(jié)果中不同菌落數(shù)區(qū)間的比較分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，餅干樣品組﹑糕點(diǎn)樣品組3種不同菌落數(shù)區(qū)間中，傾注法與紙片法檢測菌落總數(shù)結(jié)果無顯著差異（P＞0.05）。表明上述兩種檢測方法最終檢測結(jié)果基本無差異性。同時，通過對質(zhì)控樣品檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，平板計(jì)數(shù)法與紙片法均適用于食品菌落總數(shù)的測定。當(dāng)前對平板計(jì)數(shù)法與紙片法檢測食品微生物菌落總數(shù)研究結(jié)果得出，紙片法適用于場地小﹑監(jiān)測數(shù)量較多情況，且最終結(jié)果與平板計(jì)數(shù)法相同，并獲得較好檢測效果[10]。鑒于目前國內(nèi)食品微生物檢驗(yàn)中采取GB4789.2-2016標(biāo)準(zhǔn)為強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)，紙片法檢測食品菌落總數(shù)可適用于監(jiān)控食品微生物污染，并作為產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督。但食品菌落總數(shù)檢測結(jié)果在該產(chǎn)品判定標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定限度附近﹑涉及仲裁檢測，應(yīng)當(dāng)選擇平板計(jì)數(shù)法報告檢測結(jié)果。

綜上所述，菌落總數(shù)測試試片法應(yīng)用于食品菌落總數(shù)中可快速檢測，能縮短檢測流程，整體工作效率偏高，值得應(yīng)用。