Ki-67、P53和CyclinD1在小腸腺癌中的作用

作者單位：330006 南昌，南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

Ki-67、P53和CyclinD1在小腸腺癌中的作用

黃緣王素琴鄒文雄李軍王建強熊艷艷

【摘要】目的探討Ki-67、P53及CyclinD1在小腸腺癌中的表達情況及意義。方法采用SP法檢測84例小腸腺癌標(biāo)本中Ki-67、P53和CyclinD1在不同分化程度、年齡及性別的表達情況，與10例正常小腸組織進行對照，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果Ki-67、P53和CyclinD1在正常組織中未表達，而在小腸腺癌的表達隨腫瘤分化程度的降低而升高。高分化、中分化及低分化各組間比較都有明顯差異(P<0.05)。Ki-67、P53和CyclinD1在小腸腺癌的表達以中等強度為主。Ki-67、P53和CyclinD1表達在不同性別、年齡組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論Ki-67、P53和CyclinD1在小腸腺癌的惡性程度判斷方面有一定的指導(dǎo)意義。

【關(guān)鍵詞】Ki-67；P53；CyclinD1；小腸腺癌；免疫組織化學(xué)

DOI:10.3969/g.issn.0253-9802.2015.05.007

基金項目：江西省衛(wèi)生廳科技計劃(20063108)

通訊作者，黃緣，E-mail： huangy9815@163.com

收稿日期：(2014-12-17)

The significance of Ki-67, P53 and CyclinD1 in small intestine adenocarcinomaHuangYuan,WangSuqin,ZouWenxiong,LiJun,WangJianqiang,XiongYanyan.DepartmentofGastrointestinalDisease,theSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China

Correspondingauthor，HuangYuan,E-mail:huangy9815@163.com

Abstract【】ObjectiveTo investigate the expression levels and clinical significance of Ki-67, P53 and CyclinD1 in patients with small intestine adenocarcinoma. MethodsThe expression levels of Ki-67, P53 and CyclinD1 in tumor tissue from 84 small intestine adenocarcinoma patients with different degree of tumor differentiation, ages and gender were examined with SP, and normal intestinal tissues from 10 healthy individuals were used as control. ResultsKi-67, P53 and CyclinD1 were not expressed in normal small intestinal tissues, whereas the expression levels of Ki-67, P53 and CyclinD1 in small intestine adenocarcinoma samples were significantly elevated along with the declining degree of tumor differentiation with statistical significance among the high-, moderate- and low-differentiation groups(all P<0.05). Ki-67, P53 and CyclinD1 were expressed at a moderate intensity in a majority of small intestine adenocarcinoma samples. The expression of Ki-67, P53 and CyclinD1 did not significantly differ in terms of gender and age(both P>0.05). ConclusionKi-67, P53 and CyclinD1 may provide guidance for evaluating the malignancy of small intestine adenocarcinoma.

【Key words】Ki-67; P53; CyclinD1; Small intestine adenocarcinoma; Immunohistochemical test

原發(fā)性小腸腺癌(PSBA) 是一種罕見的消化道惡性腫瘤，約占胃腸道惡性腫瘤的5%，以40～60歲多見，男女發(fā)病相當(dāng)。近年來小腸腺癌的發(fā)病率明顯提高，由于缺乏典型癥狀和高敏感度、特異度的影像學(xué)檢查方法，常導(dǎo)致小腸腺癌的誤診漏診。目前小腸鏡檢查是確診的主要手段，結(jié)合小腸CT及MRI等檢查手段，可大大提高小腸腫瘤的診斷率[1-5]。

Ki-67是一種存在于增殖細胞中的核抗原，其表達于細胞周期的G1→M期，在G0期表達受到抑制， 是細胞進入增殖周期的較好標(biāo)志[6-10]。P53基因是正常細胞生長和分裂的重要負調(diào)控因子，突變型P53則發(fā)揮著原癌基因的作用，可促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[11-13]。細胞周期蛋白D(CyclinD)是目前公認(rèn)的癌基因， CyclinD1是細胞由G1→S期轉(zhuǎn)換的限速因素，CyclinD1過度表達是導(dǎo)致G1→S期檢驗點功能缺陷的主要原因，這一缺陷也使得某些基因突變或染色體異常的細胞得以增殖,從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[14-15]。本研究采用免疫組織化學(xué)的方法探討Ki-67、P53和CyclinD1蛋白在84例小腸腺癌中的表達，為小腸腺癌的診斷、惡性程度判斷及預(yù)后提供更有力的依據(jù)。

材料與方法

一、 標(biāo)本來源

收集2008年6月至2012年6月南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院小腸腺癌經(jīng)外科手術(shù)或內(nèi)鏡下切除的、病理證實有完整臨床資料的存檔蠟塊。小腸腺癌84例，男48例，女36例，平均年齡為52歲，小于52歲38例，大于等于52歲46例，包括高分化腺癌12例，中分化腺癌51例，低分化腺癌21例。正常對照組10例，正常對照組和腺癌組的性別、年齡分布比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

二、 方法

所用試劑均購于福州邁新生物技術(shù)有限公司：①DAB顯色試劑盒；②鼠抗人Ki-67、P53和CyclinDl單克隆抗體SP超敏免疫組織化學(xué)試劑盒；③檸檬酸緩沖液。將收集組織標(biāo)本連續(xù)切片3張，置于72℃烘箱3 h。采用SP法檢測Ki-67、P53和CyclinD1的操作步驟如下：①脫蠟水化；②微波熱修復(fù)；③阻斷內(nèi)源性過氧化酶的活性；④水沖洗，蘇木素復(fù)染5～10 s，流水再次沖洗；PBS液洗3次×5 min；⑤脫水、透明、固封、鏡檢，顯微鏡下觀察。Ki-67、P53和CyclinD1均定位在細胞核，當(dāng)相應(yīng)抗體染色出現(xiàn)在細胞核中，顯現(xiàn)出棕黃色顆粒為陽性，單純胞漿著色或胞漿、胞核均無著色為陰性。先低倍鏡(×100)定位，再用高倍鏡(×400)觀察，截取5個視野，每個視野計數(shù)100個腫瘤細胞，總計500個，記錄陽性表達的細胞數(shù)，從而計算出Ki-67、P53和CyclinD1的陽性率。陽性判斷以陽性細胞所占比例不同分為：①無或陽性細胞率<5%為(-)；②5%≤陽性細胞率<25%為(+)；③25%≤陽性細胞率<50%為(++)；④陽性細胞率≥50%為(+++)[3]。

三、 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件分析處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、 小腸腺癌高、中及低分化組Ki-67、P53及CyclinD1的表達情況比較

與正常小腸組織對比，Ki-67、P53及CyclinD1在小腸腺癌陽性表達率分別為57.1%、42.9%和44.1%。Ki-67、P53及CyclinD1在84例小腸腺癌高、中及低分化組比較均有明顯差異(P<0.05)，說明3種蛋白的表達均隨腫瘤惡性程度的升高而升高(見表1)。Ki-67、P53和CyclinD1蛋白陽性表達均為細胞核著棕黃色。Ki-67、P53及CyclinD1在小腸腺癌高分化、中分化及低分化組表達強度由弱陽性逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楦邚姸葹橹?見表2、圖1)。

表1

Ki-67、P53和CyclinD1在不同分化程度小腸腺癌中的表達情況　例(%)

注：χ2Ki-67分化程度= 11.198；χ2P53分化程度= 10.760；χ2CyclinD1分化程度= 8.950

表2

Ki-67、P53和CyclinD1在小腸腺癌中

二、Ki-67、P53、CyclinD1在不同年齡、性別小腸腺癌中的表達情況

Ki-67、P53、CyclinD1在不同年齡、性別小腸腺癌中的表達比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

討論

Ki-67可用來衡量腫瘤細胞生長的速度，特別適用于評估臨床腫瘤標(biāo)本的細胞增殖速度和患者的預(yù)后。應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默Ki-67能有效降低腫瘤細胞生長，引起細胞凋亡，進而抑制腫瘤的生長。因此Ki-67可廣泛應(yīng)用于預(yù)測各種腫瘤的增殖活性，判定疾病的惡性程度，也被應(yīng)用于定量分析腫瘤的生長分?jǐn)?shù)、腫瘤的分級、增生程度及預(yù)后的預(yù)測[16-17]。野生型P53基因是細胞生長的負調(diào)節(jié)因子,阻止細胞G1期進入S期，能夠監(jiān)視細胞基因組的完整性, 修復(fù)各種原因?qū)е碌腄NA損傷及降低各種有癌變傾向的細胞而起抑癌作用[18-19]。該研究結(jié)果與Song和Lee等[20-21]的研究基本一致。因此檢測突變型P53表達水平可作為小腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的一項潛在分子標(biāo)志。CyclinD1是細胞由G1期向S期轉(zhuǎn)換的重要限速因素，CyclinD1在病理狀態(tài)下，基因激活且持續(xù)高表達，將導(dǎo)致G1期縮短，提前進入S期，是導(dǎo)致G1/S期檢測點缺陷主要原因。檢測點功能缺陷可能會導(dǎo)致遺傳基因突變和染色體結(jié)構(gòu)異常的細胞獲得增殖，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[22]。

圖1　Ki-67、P53及CyclinD1在小腸腺癌高分化、中分化及低分化組的表達

A～C:Ki-67在高分化、中分化及低分化小腸腺癌中的表達情況(SP,×400)；D～F：P53在高分化、中分化及低分化小腸腺癌中的表達情況(SP,×400)；G～I：CyclinD1在高分化、中分化及低分化小腸腺癌中的表達情況(SP,×400)

表3

Ki-67、P53、CyclinD1在不同年齡、性別小腸腺癌中的表達情況　例(%)

內(nèi)鏡及影像技術(shù)日益成熟，小腸腺癌檢出率也越來越高，但由于小腸解剖部位的特殊性，明確診斷仍有一定難度。 Ki-67、P53和CyclinD1與其他腫瘤的相關(guān)研究較大，因小腸腫瘤為罕見疾病，收集病理較困難，因此與小腸腫瘤相關(guān)的研究在國內(nèi)較少見。本實驗采用免疫組織化學(xué)SP方法，在病理診斷中的應(yīng)用廣泛, 已是病理診斷必不可少的手段。影響免疫組織化學(xué)染色切片無特異性表達或表達弱及背景深、 非特異性染色強原因很多，包括標(biāo)本的固定、內(nèi)源性過氧化物酶引起非特異性抗體的選擇、抗原修復(fù)及染色等[23]。本實驗均已盡量避免其引起的誤差。收集病例標(biāo)本充分，排除了年齡、性別及學(xué)歷背景等差異。對標(biāo)本用免疫組化法聯(lián)合檢測Ki-67、P53和CyclinD1，顯示各檢測指標(biāo)的表達強度與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)，但與年齡、性別無明顯相關(guān)性。使用簡便的檢測應(yīng)用到臨床工作中，對診斷困難的小腸疾病有較大意義，對小腸腺癌的惡性程度判斷、發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有重要指導(dǎo)意義。 可進一步研究相關(guān)基因引起腫瘤的機制，為腫瘤的基因靶向治療提供依據(jù)。

參考文獻

[1]Strickland L, Letson GD, Muro-Cacho CA. Gastrointestinal stromal tumors. Cancer Control，2001，8(3):252-261.

[2]Gupta P, Tewari M, Shukla HS. Gastrointestinal stromal tumor. Surg Oncol，2008，17(2):129-138.

[3]牛俊楊,王曉秋，胡聞.胃腸道間質(zhì)瘤的臨床病理及免疫組化觀察.安徽醫(yī)學(xué),2011,24(5):22.

[4]Miettinen M, Lasota J. Gastrointestinal stromal tumors-definition, clinical, histological, immunohistochemical, and molecular genetic features and differential diagnosis. Virchows Arch，2001，438(1):1-12.

[5]Chiappa A, Zbar AP, Biffi R, Bertani E, Pace U, Pruneri G, Della Vigna P, Grassi C, Valerio M, Poldi D, Andreoni B. Prognostic factors and outcome of resected patients for gastrointestinal stromal tumors. Hepatogastroenterology，2007，54(75):693-696.

[6]Kuratomi K, Yano H, Tsuneoka M, Sakamoto K, Kusukawa J, Kojiro M.Immunohistochemical expression of Mina53 and Ki67 proteins in human primary gingival squamous cell carcinoma. Kurume Med J，2006，53(3-4):71-78.

[7]Schlüter C, Duchrow M, Wohlenberg C, Becker MH, Key G, Flad HD, Gerdes J. The cell proliferation-associated antigen of antibody Ki-67: a very large, ubiquitous nuclear protein with numerous repeated elements, representing a new kind of cell cycle-maintaining proteins. J Cell Biol，1993，123(3):513-522.

[8]Fusco A, Zatelli MC, Bianchi A, Cimino V, Tilaro L, Veltri F, Angelini F, Lauriola L, Vellone V, Doglietto F, Ambrosio MR, Maira G, Giustina A, degli Uberti EC,Pontecorvi A, De Marinis L.Prognostic significance of the Ki-67 labeling index in growth hormone-secreting pituitary adenomas. J Clin Endocrinol Metab，2008，93(7):2746-2750.

[9]Matsuta M, Kimura S, Kosegawa G, Kon S, Matsuta M. Immunohistochemical detection of Ki-67 in epithelial skin tumors in formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections using a new monoclonal antibody (MIB-1). J Dermatol，1996，23(3):147-152.

[10]Romeo S, Debiec-Rychter M, Van Glabbeke M, Van Paassen H, Comite P, Van Eijk R, Oosting J, Verweij J, Terrier P, Schneider U, Sciot R, Blay JY,Hogendoorn PC; European Organization for Research and Treatment of Cancer Soft Tissue and Bone Sarcoma Group. Cell cycle/apoptosis molecule expression correlates with imatinib response in patients with advanced gastrointestinal stromal tumors.Clin Cancer Res，2009，15(12):4191-4198.

[11]Jiang J, Jin MS, Suo J, Wang YP, He L, Cao XY. Evaluation of malignancy using Ki-67, p53, EGFR and COX-2 expressions in gastrointestinal stromal tumors. World J Gastroenterol，2012，18(20):2569-2575.

[12]劉祖宏，倪仰鵬，黃綺國，許文兵，陳宋欽.乳腺癌新分子分型中的 P53 蛋白表達及臨床評估.新醫(yī)學(xué)， 2013，44(3)：166-168.

[13]Farnebo M, Bykov VJ, Wiman KG. The p53 tumor suppressor: a master regulator of diverse cellular processes and therapeutic target in cancer. Biochem Biophys Res Commun，2010，396(1):85-89.

[14]Moghaddam SJ, Haghighi EN, Samiee S, Shahid N, Keramati AR, Dadgar S, Zali MR. Immunohistochemical analysis of p53, cyclinD1, RB1, c-fos and N-ras gene expression in hepatocellular carcinoma in Iran. World J Gastroenterol，2007，13(4):588-593.

[15]Udhayakumar G, Jayanthi V, Devaraj N, Devaraj H. Interaction of MUC1 with beta-catenin modulates the Wnt target gene cyclinD1 in H. pylori-induced gastric cancer. Mol Carcinog，2007，46(9):807-817.

[16]Jalava P, Kuopio T, Juntti-Patinen L, Kotkansalo T, Kronqvist P, Collan Y. Ki67 immunohistochemistry: a valuable marker in prognostication but with a risk of misclassification: proliferation subgroups formed based on Ki67 immunoreactivity and standardized mitotic index. Histopathology，2006，48(6):674-682.

[17]Czyzewska J,Guzińska-UstymowiczK, Lebelt A, Zalewski B, Kemona A. Evaluation of proliferating markers Ki-67, PCNA in gastric cancers. Rocz Akad Med Bialymst，2004，49(Suppl 1):64-66.

[18]務(wù)森,張謝夫,趙春臨, 劉濤.胃腸道間質(zhì)瘤組織中Ki-67,Cyclin D1,ICAM-1,Livin 及MMP-9蛋白表達與危險度分級.鄭州大學(xué)學(xué)報: 醫(yī)學(xué)版,2011,46(6): 895-897．

[19]Oren M, Rotter V.Mutant p53 gain-of-function in cancer. Cold Spring Harb Perspect Biol，2010，2(2):a001107.

[20]Song HS, Kim IH, Sohn SS, Kwon KY, Lee WS. Prognostic significance of immunohistochemical expression of p53 and retinoblastoma gene protein (pRB) in curatively resected gastric cancer. Korean J Intern Med，2005，20(1):1-7.

[21]Lee KE, Lee HJ, Kim YH, Yu HJ, Yang HK, Kim WH, Lee KU, Choe KJ, Kim JP. Prognostic significance of p53, nm23, PCNA and c-erbB-2 in gastric cancer. Jpn J Clin Oncol，2003，33(4):173-179.

[22]Lange C, Huttner WB, Calegari F.Cdk4/cyclinD1 overexpression in neural stem cells shortens G1, delays neurogenesis, and promotes the generation and expansion of basal progenitors. Cell Stem Cell，2009，5(3):320-331.

[23]王銀萍，閆旭． 免疫組化在腫瘤診斷中的應(yīng)用及其臨床意義．實用腫瘤學(xué)雜志， 2007， 21(6):580-581．

(本文編輯：楊江瑜)

臨床研究論著