BDNF通過AKT/mTOR/70S6K途徑影響Aβ25-35誘導的HT22細胞自噬的研究

作者單位：510120 廣州，中山大學孫逸仙紀念醫院神經科(范勝諾，廖旺，劉軍)，麻醉科(谷貝貝)；510080 廣州，廣東藥學院附屬第一醫院神經科(張蓓)；510080 廣州,中山大學中山醫學院在讀碩士研究生(范勝諾)

BDNF通過AKT/mTOR/70S6K途徑影響Aβ25-35誘導的HT22細胞自噬的研究

范勝諾張蓓谷貝貝廖旺劉軍

【摘 要】目的探討腦源性神經生長因子(BDNF)對抗β-淀粉樣蛋白25-35的神經毒性作用是否與自噬有關，以及該自噬過程是否通過蛋白激酶B(AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/核糖體蛋白S6激酶(70S6K)途徑調控。 方法將Aβ25-35加入不同濃度BDNF預處理后的HT22細胞共孵育24 h，采用CCK8法測細胞活力；將Aβ25-35及加或不加BDNF、Rapamycin、LY294002處理HT22細胞24 h，采用蛋白免疫印跡法檢測LC3、p-AKT、p-70S6K的表達；采用免疫熒光法檢測細胞核周自噬斑點變化情況。結果BDNF能改善細胞活力，以100 ng/ml時最為顯著(P<0.05)；Aβ25-35升高LC3-Ⅱ/Ⅰ比值，降低p-AKT、p-70S6K的表達，并增加細胞自噬斑點數量(P均<0.05)；BDNF能增強Aβ25-35誘導的自噬活動，該增強作用可被LY294002抑制(P均<0.05)。結論BDNF能對抗Aβ25-35的神經毒性，與通過AKT/mTOR/70S6K途徑增強Aβ25-35誘導的HT22細胞自噬相關。

【關鍵詞】腦源性神經營養因子；β-淀粉樣蛋白25-35；HT22細胞；自噬

DOI:10.3969/g.issn.0253-9802.2015.06.004

基金項目：國家自然科學基金(81372919)；廣東省自然科學基金(S2013010013964)

通訊作者，劉軍， E-mail：docliujun@126.com

收稿日期：(2014-12-31)

Effect of BDNF on Aβ25-35-induced autophagy via AKT/mTOR/70S6K pathway in HT22 cellsFanShengnuo,ZhangBei,GuBeibei,LiaoWang,LiuJun.SunYat-senMemorialHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China

CorrespondingAuthor,LiuJun,E-mail:docliujun@126.com

Abstract【】ObjectiveTo investigate the correlation between neuroprotective effect of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) against Amyloid β-proiein25-35 neurotoxicity, and validate whether the autophagy was regulated by protein kinase B (AKT)/ mammalian target of rapamycin (mTOR)/ ribosomal protein S6 kinase (70S6K) signaling pathway. MethodsAβ25-35 was supplemented and co-cultured with the HT22 cells pretreated with different concentrations of BDNF for 24 h. The viability of HT22 cells was evaluated by cell counting kit-8 (CCK8). The expression levels of microtubule-associated protein light chain 3 (LC3), p-AKT, p-70S6K in HT22 cells were detected by Western blot after treated with Aβ25-35 in the presence or absence of BDNF, rapamycin, LY294002 for 24 h. Immunofluorescence assay was performed to observe the changes in the LC3 puncta in the perinuclear region of HT22 cells. ResultsBDNF could improve HT22 cell viability, especially at the concentration of 100 ng/ml (P<0.05). Aβ25-35 elevated the LC3-Ⅱ/Ⅰ ratio, down-regulated the expression of p-AKT and p-70S6K and increased the number of LC3 puncta in HT22 cells (all P<0.05). BDNF enhanced the autophagy induced by Aβ25-35, which could be inhibited by LY294002 (both P<0.05). ConclusionsBDNF is able to alleviate the neurotoxicity of Aβ25-35 by promoting the Aβ25-35-induced HT22 autophagy via AKT/mTOR/70S6K signaling pathway.

【Key words】Brain derived neurotrophic factor; Amyloid β-protein25-35; HT22 cells; Autophagy

阿爾茨海默病(AD)是常見的的中樞神經系統退行性疾病，以廣泛的神經元丟失、神經纖維纏結(NFTs)及腦內大量β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積形成為典型病理改變。在腦內異常形成并堆積的Aβ產生的神經毒性是AD形成和發展的重要因素[1-2]。有學者發現，在AD患者大腦中，腫脹的發生營養障礙的神經突中含有大量的自噬泡，Aβ累積在自噬泡中，提示自噬系統與AD的發病機制密切相關，AD患者的細胞自噬功能有不同程度的損傷[1]。腦源性神經生長因子(BDNF)在神經元的存活中起重要作用，有研究表明部分BDNF是通過調控磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)及下游蛋白激酶B (PKB/AKT)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖體蛋白S6激酶(70S6K)，即AKT/mTOR/70S6K途徑參與完成自噬等活動[3-4]。我們既往使用Aβ25-35處理HT22細胞以模擬AD時發現，Aβ25-35可誘導HT22發生自噬[5]。但是該自噬活動的機制尚未明確，因此本課題旨在觀察BDNF對Aβ25-35處理的HT22細胞有無保護作用，并探討該保護作用是否與自噬活動相關以及AKT/mTOR/70S6K途徑在其中的作用，以期為AD的治療提供新思路。

材料與方法

一、儀器與試劑

主要儀器包括Thermo恒溫培養箱、奧林巴斯BX51WI研究級正置熒光顯微鏡、Spectramax M5多功能酶標儀、BIO-RAD電泳儀及電轉儀；CCK-8購自日本同仁公司；胰蛋白酶、DMEM培養基、FBS胎牛血清、Neurobasal培養基和N2添加劑均購自Gibco公司；自噬激活劑Rapamycin、自噬抑制劑LY294002 購于美國Sigma-Aldrich公司； 重組人型BDNF購自BioVision公司；抗LC3抗體購自MBL公司，其余一抗(p-AKT、p-70S6K、Tublin)及二抗均購自CST公司，所有一抗均為兔抗小鼠抗體，二抗為羊抗兔抗體；Aβ25-35由上海生工生物工程股份有限公司合成；ECL發光液購自Millipore公司，BCA法蛋白濃度測定試劑盒及其余試劑購自武漢博士德公司。

二、細胞培養及藥物處理

HT22細胞株，是1種永生化的小鼠海馬神經元細胞，其培養及分化參照文獻[6]，由本實驗組凍存。Aβ25-35老化處理及合適工作濃度(10 μM、40 μM)由本課題前期工作確定[5]。根據分組需要分別加入以下試劑，于Aβ25-35處理前2 h加入不同濃度的BDNF，于Aβ25-35處理前0.5 h加入Rapamycin(1 μM)、LY294002(20 μM)。

三、CCK8法測細胞活力

將HT22細胞以5×104/ml的密度種植于96孔細胞培養板中，分4組、每組設5個復孔，重復做3次，并設立對照組。各組分化后加入不同濃度的BDNF(10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、500 ng/ml)處理2 h后加入Aβ25-35共培養24 h，對照組不加任何藥物。每孔加入10 L的CCK-8試劑于37 ℃、5%二氧化碳培養箱內溫育1.5 h，用酶標儀于450 nm波長處測定各孔的吸光度并計算細胞活力。

四、蛋白免疫印跡法檢測LC3等蛋白的表達

根據CCK8法得出BDNF合適濃度為100 ng/ml，分別以Aβ25-35及加或不加BDNF、Rapamycin(1 μM)、LY294002(20 μM)處理HT22細胞24 h，裂解后用BCA法測定蛋白濃度，各組蛋白濃度統一為30 μg/ml，加上樣緩沖液、變性后用12 %分離膠電泳分離蛋白后濕轉到硝酸纖維素膜上，5 %脫脂奶粉室溫封閉1 h, 加入一抗(LC3、p-AKT、p-70S6K，Tublin均為1∶1 000)，4 ℃過夜，TBST洗膜15 min×3次，二抗(1∶3 000)室溫1 h ，TBST洗膜15 min×3次后用ECL法曝光。

五、免疫熒光法測定自噬小體

參考文獻[5-6]前期基礎研究方法，取對數生長的HT22細胞種于24孔細胞培養板的細胞爬片上，貼壁后以Aβ25-35及加或不加BDNF、Rapamycin(1 μM)、LY294002(20 μM)處理HT22細胞24 h，用4%多聚甲醛溶液固定15 min，透膜封閉后加入一抗Anti-LC3于4 ℃孵育過夜，加入二抗常溫孵育1 h，DAPI染核5 min后封片，并于正置熒光顯微鏡下拍照。

六、統計學處理

結果

一、BDNF和Aβ25-35對細胞活力的影響

單獨使用BDNF處理濃度為10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml時，細胞活力與對照組比較差異無統計學意義，當BDNF處理濃度為500 ng/ml時細胞活力明顯降低(圖1A)；單獨予Aβ25-3540 μM時，細胞活力降低，與我們前期研究結果一致，而預先使用不同濃度BDNF與Aβ25-35共處理時，我們發現，BDNF濃度為50 ng/ml、100 ng/ml時均能改善細胞活力，其中以100 ng/ml時最為顯著，提示了BDNF有對抗Aβ25-35細胞毒性作用，我們以100 ng/ml BDNF濃度為后續工作濃度(圖1B)。

圖1　BDNF處理及BDNF預處理后加入Aβ 25-35 24 h對細胞活力的影響

A：經不同濃度BDNF處理后結果，可見單獨使用BDNF時，當濃度為500 ng/ml時細胞活力出現降低[活力為(76.217±5.832)%]，與對照組比較，*為t=7.113，P<0.001；B：經Aβ25-3540μM 與不同濃度BDNF處理時，BDNF濃度為50 ng/ml[活力為(85.600±4.615)%]、100 ng/ml[活力為(94.800±3.962)%]時細胞活力均得到改善，其中以100 ng/ml時最明顯；2組比較，*為t=4.437、P=0.017，**為t=7.839、P<0.001

二、Aβ25-35處理對LC3、p-AKT、p-70S6K表達強度的影響

LC3是自噬活動的標志蛋白，自噬發生時LC3-Ⅰ轉變為LC3-Ⅱ，因此LC3-Ⅱ/Ⅰ比值能大致反映自噬水平的高低(參考2012年的《Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy》)。我們單獨予Aβ25-35處理HT22細胞24 h，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值高于對照組，而40 μM處理組較10 μM 處理組比值高(圖2A)；PI3K通路標志蛋白AKT、70S6K磷酸化水平的比較結果示，Aβ25-35處理抑制了p-AKT、p-70S6K的表達，較之10 μM 處理組，40 μM處理組的抑制效果更明顯(圖2B)，這提示可能是PI3K通路參與了Aβ25-35誘導的HT22細胞自噬活動。當使用BDNF、自噬抑制劑LY294002與Aβ25-35共孵育，以及Rapamycin作為陽性對照時，與單獨使用Aβ25-35比較，BDNF進一步升高了LC3-Ⅱ/Ⅰ比值，該升高效益可被LY294002抑制(圖3A、B)；同樣的，BDNF可降低p-AKT、p-70S6K的表達，LY294002能抑制該作用(圖3C、D)，這提示BDNF可通過PI3K途徑增強Aβ25-35誘導的HT22細胞自噬活動。

圖2　Aβ 25-35處理24 h后LC3、p-AKT、p-70S6K表達強度

A：蛋白免疫印跡圖 。B：定量分析圖，可見Aβ25-35處理HT22細胞24 h，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值高于對照組(與對照組比較，*為P<0.05)，40 μM處理組較10 μM 處理組升高(2組比較，# 為P<0.05)；各組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值如下，對照組為0.400±0.079，10 μM組為1.580±0.192，40 μM組為4.510±0.361；各組比較的t值及P值如下,對照組vs. 10 μM組t=7.804，P<0.001；對照組vs. 40 μM組t=34.778，P<0.001；10 μM組vs. 40 μM組t=19.312，P<0.001。Aβ25-35處理抑制了p-AKT、p-70S6K的表達(與對照組比較，*為P<0.05)，較之10 μM 處理組，40 μM處理組抑制效果更明顯(#為P<0.05)，各組p-AKT/Tublin表達如下，對照組為0.810±0.152，10 μM組為0.300±0.037，40 μM組為0.137±0.019；各組比較的t值及P值如下,對照組vs.10 μM組t=8.883，P<0.001；對照組vs. 40 μM組t=11.531，P<0.001；10 μM組vs. 40 μM組t=2.648，P=0.044。各組pS6K/Tublin表達如下，對照組為1.580±0.202；10 μM組為0.800±0.158；40 μM組為0.360±0.065；各組比較的P值及t值如下, 對照組vs.10 μM組t=8.074，P<0.001；對照組vs. 40 μM組t=12.628，P<0.001；10 μM組vs. 40 μM組t=4.554，P=0.002

圖3　BDNF對LC3、p-AKT、p-70S6K表達的影響

A：蛋白免疫印跡圖。B：定量分析，比起單獨使用Aβ25-35，BDNF進一步升高了LC3-Ⅱ/Ⅰ比值(與對照組比較，*為P<0.05；2組間比較，#為P<0.05)，各組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值如下，Aβ25-35組為2.500±0.292，Aβ25-35+BDNF組為6.520±0.581，Aβ25-35+BDNF+LY組為2.040±0.336，Aβ25-35+Rapa組為4.440±0.365；各組比較的t值與P值如下，Aβ25-35組vs. Aβ25-35+BDNF組為t=16.75、P<0.001，Aβ25-35+BDNF組vs. Aβ25-35+BDNF+LY組 為t=18.667、P<0.001，Aβ25-35組vs. Aβ25-35+Rapa組為t=8.083、P<0.001。C、D：定量分析，對比單獨使用Aβ25-35，BDNF能進一步降低p-AKT、p-70S6K的表達，LY294002能抑制BDNF上述作用，各組p-AKT/Tublin表達如下，Aβ25-35組為1.010±0.297，Aβ25-35+BDNF組為 0.470±0.079，Aβ25-35+BDNF+LY組為1.360±0.297，Aβ25-35+Rapa組為0.634±0.117；各組比較的t值與P值如下，Aβ25-35組vs. Aβ25-35+BDNF組t=3.333、P=0.033；Aβ25-35+BDNF組vs. Aβ25-35+BDNF+LY組為t=5.494、P<0.001；Aβ25-35組vs. Aβ25-35+Rapa組 為t=2.321、P= 0.031。各組p-70S6K/Tublin表達如下，Aβ25-35組為0.600±0.127，Aβ25-35+BDNF組為 0.216±0.048，Aβ25-35+BDNF+LY組為0.601±0.091，Aβ25-35+Rapa組為0.402±0.042；各組比較的t值與P值如下，Aβ25-35組vs. Aβ25-35+BDNF組t=7.385、P<0.001 ，Aβ25-35+BDNF組vs. Aβ25-35+BDNF+LY組t=0.737、P<0.001，Aβ25-35組vs. Aβ25-35+Rapa組t=3.799、P= 0.011

三、不同處理組HT22細胞內免疫熒光斑點及定量分析結果

使用LC3抗體對各處理組進行染色，發現經Aβ25-35處理后的HT22細胞核周出現明顯斑點狀結構，預先使用BDNF后，細胞中高亮的斑點更多，甚至成斑塊狀，LY294002能減少BDNF導致的大量斑點形成(圖4)。

圖4　不同處理組HT22細胞內免疫熒光斑點及定量分析

Aβ組結果示經Aβ25-35處理后的HT22細胞核周出現明顯斑點狀結構(箭頭所示為熒光斑點)；Aβ+BDNF組結果示合用BDNF后的細胞斑點更多，甚至成斑塊狀；Aβ+BDNF+LY 組結果示LY294002能抑制BDNF的作用；Rapa組為陽性對照組。對照組斑點定量為(4.100±1.581) Dots/Unit，Aβ25-35組為(44.020±7.778) Dots/Unit，Rapa組為(45.715±4.527)Dots/Unit，Aβ25-35+BDNF組為(65.200±10.986)Dots/Unit，Aβ25-35+BDNF+LY組為(30.060±7.021)Dots/Unit。各組比較的t值與P值如下，對照組vs.Aβ25-35組t=8.889、P<0.001，對照組vs.Rapat=9.111、P<0.001，對照組vs. Aβ25-35+BDNF組t=13.556、P<0.001，對照組vs.Aβ25-35+BDNF+LY組t=5.911、P<0.001，Aβ25-35組vs. Aβ25-35+BDNF組t=4.711、P=0.001，Aβ25-35+BDNF組vs.Aβ25-35+BDNF+LY組t=7.689、P<0.001。柱狀圖所示，與對照組比較，*為P<0.05；2組間比較，#為P<0.05

討論

AD病理機制的研究和藥物的開發已成為醫學界關注的老年病熱點問題，目前針對AD的基礎研究主要集中在抑制Aβ異常聚集，AD患者大腦中過度聚集的Aβ主要由清除障礙引起，因此，清除AD患者大腦中過度聚集的Aβ是治療的關鍵點[7]。

自噬作為細胞在不利環境下的1種存活機制，可通過將細胞內的長壽命蛋白、可溶性蛋白、受損細胞器等胞內物質轉運到溶酶體進行降解，重新利用以滿足細胞所需，從而降低毒性物質對細胞的傷害，這其中就包括Aβ這種難以降解的蛋白[8-9]。自噬過程中形成自噬泡，為包裹廢棄的細胞質和細胞器的雙層膜結構，它和溶酶體融合形成成熟的自噬溶酶體，更好地對胞內成分如衰老受損的細胞器、無生物功能的大分子進行降解，還能解除蛋白質異常折疊，起細胞清道夫的作用。自噬功能障礙與各種神經變性疾病，如AD、帕金森病、亨廷頓病等關系密切[10]。研究表明，AD患者大腦神經元中含有大量的自噬泡，Aβ積聚在自噬泡中，且自噬功能有不同程度的障礙。我們既往在使用海馬神經元細胞系HT22接受Aβ25-35干預以體外模擬AD時發現，高濃度Aβ25-35對HT22細胞有明顯的毒性作用，且與細胞自噬功能密切相關[5]。本研究再次證實了Aβ25-35能誘導HT22細胞發生自噬，且該自噬與處理濃度相關。

BDNF與原肌球蛋白受體激酶(TrkB)結合后可激活絲裂原激活蛋白激酶/細胞外信號調節激酶(MAPK/ERK)、磷脂酶Cg(PLCg)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)通路，其中PI3K通路對神經元細胞發育、分化、再生、存活、突觸可塑性、軸突逆向運輸等有著重要作用[11]。研究表明，BDNF能有效對抗缺氧、自由基損傷、Aβ等導致的神經毒性[3-4, 12]。本研究也觀察到BDNF能改善Aβ25-35導致的細胞活力降低。哺乳動物mTOR是自噬的負調控因子，是1種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細胞的增殖和生長中發揮重要作用。mTOR在神經元軸突的伸展方向、樹突的發育和樹突棘的形狀過程中都至關重要[13-14]。PI3K通過AKT/mTOR/70S6K調控自噬活性是一重要的信號級聯，研究表明，激活的PI3K/AKT信號通路作用于mTOR抑制神經元凋亡；磷酸化的AKT能激活下游的 TSC1/2，進一步磷酸化mTOR、mTOR通過抑制下游分子ULK1復合體來調控自噬，因此AKT、p70S6K磷酸化水平與自噬水平成反比[15]。我們使用Aβ25-35誘導HT22細胞發生自噬時，p-AKT、p-70S6K表達降低，熒光圖顯示自噬斑點增多，而加用BDNF后p-AKT、p-70S6K表達進一步降低，自噬斑點進一步增多，且自噬抑制劑LY294002在一定程度上能抵消BDNF的作用，提示BDNF在此自噬活動中對Aβ25-35有同向增強的效果。結合使用BDNF后能緩解Aβ25-35導致的細胞活力降低，我們認為BDNF能對抗Aβ25-35的神經毒性，與增強神經元自噬及調控AKT/mTOR/70S6K通路相關。

在一些神經疾病中，自噬活性的高水平對神經元的存活極其不利，但在AD的研究中，較多研究者傾向于自噬對神經元變性有明顯的改善作用[16-18]。本研究發現BDNF通過AKT/mTOR/70S6K途徑增強Aβ25-35誘導的神經元自噬，這種自噬的發生伴隨著HT22細胞活力的改善。也有學者認為通過激活mTOR，可在一定情況下阻止細胞發生自噬從而加速細胞死亡，而抑制 mTOR則能加強自噬以消化胞內異常聚集的蛋白以使細胞存活[19]。自噬作為一把雙刃劍，活性過高或過低均不利于細胞功能的穩定，AKT/mTOR/70S6K通路調控自噬可能存在一“平衡點”，但目前我們對這個“平衡點”仍處于未知階段。BDNF是如何增強神經元自噬的調控機制需要我們作進一步探討。

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(本文編輯：洪悅民)

基礎研究論著