三種HCV RNA熒光定量PCR檢測試劑的結果分析及應用比較

作者單位: 510630 廣州，中山大學附屬第三醫院感染科(淦偉強,嚴穎，林潮雙)，肝病實驗室(黃小慧)，超聲科(譚雷)

三種HCV RNA熒光定量PCR檢測試劑的結果分析及應用比較

淦偉強黃小慧譚雷嚴穎林潮雙

【摘要】目的比較3種丙型肝炎病毒(HCV) RNA熒光定量PCR檢測試劑的臨床應用性能。方法采用國產A試劑(磁珠分離法)、國產B試劑(熒光探針法)和目前國際臨床廣泛應用的C試劑(內標法)同時檢測110例丙型肝炎患者臨床血液樣本及梯度稀釋的強陽性標本，從試劑間的相關性、檢測靈敏度、特異度等對結果進行對比分析。結果A和B、A和C、B和C試劑間的相關系數分別為0.845、0.917、0.860(P均<0.01)。在3種方法均有數值的58例標本中，3種試劑所檢出的HCV RNA水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。但在低病毒載量(<103IU/ml)組中，3種試劑靈敏度比較差異有統計學意義(P<0.01)，C試劑靈敏度最高，A試劑次之，B試劑最低。當病毒載量在2.00×103～2.00×106 IU/ml時，3種試劑的定量結果與理論值均有很好的相關性與重復性，其檢測濃度的平均值與理論濃度的雙對數線性相關系數分別為0.9983、0.9823、0.9999(P均<0.01)；當病毒載量為2.00×102 IU/ml時，C試劑的檢測結果最接近，A試劑次之，B試劑未能檢出。結論C試劑作為國際上廣泛應用于臨床HCV RNA定量檢測的試劑，優勢明顯；國產A試劑總體性能優于B試劑，且費用較國外試劑低廉，性價比較高。

【關鍵詞】丙型肝炎；病毒；核酸定量；試劑；檢測

DOI：10.3969/g.issn.0253-9802.2015.06.007

基金項目：國家自然科學基金(31370907)；廣東省自然科學基金(S2012010009155)；十二五國家科技重大專項(2012ZX10002007)

通訊作者，林潮雙，E-mail：linchaoshuang@126.com

收稿日期：(2015-01-06)

Comparison of application of three types of HCV-RNA fluorescent quantitative PCR detection reagentsGanWeiqiang,HuangXiaohui,TanLei,YanYing,LinChaoshuang.InfectiousDiseaseDepartment,theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China

Correspondingauthor,LinChaoshuang,E-mail:linchaoshuang@126.com

Abstract【】ObjectiveTo compare the clinical application performance of three types of hepatitis C virus (HCV)-RNA fluorescent quantitative PCR detection reagents. MethodsDomestic A reagent (magnetic bead separation method), domestic B reagent (fluorescence probe method) and C reagent currently widely used internationally (internal standard method) were adopted to detect 110 clinical blood in patients with Hepatitis and strong-positive samples with gradient dilution. The correlation, sensitivity and specificity were statistically compared among the results of three detection reagents. ResultsThe correlation coefficient of three types of reagents was 0.845, 0.917 and 0.860 (all P<0.01). In 58 samples detectable by three methods, no significant difference was found in HCV RNA level among three kinds of reagents (P>0.05). However, in the low viral load group (<1.00×103 IU/ml), the sensitivity significantly differed among three types of reagents with highest sensitivity in C reagent, followed by A and B reagents. In the viral load group (2.00×103～2.00×106 IU/ml), high levels of correlation and repeatability between the quantitative results and theoretical values were observed in all reagents. The double logarithmic linear correlation coefficient of the mean and theoretical concentration was 0.9983, 0.9823 and 0.9999 (all P<0.01). When the viral load was 2.00×102 IU/ml, the detected concentration was the most similar to the theoretical concentration in C reagent, followed by A reagent and undetected in B reagent. ConclusionsC reagent was superior to A and B reagents in the HCV-RNA fluorescent quantitative PCR detection. Compared with B reagent, A reagent exhibited better performance. A reagent was cheaper compared with C reagent. Thus, A reagent could be used as a cost-effective HCV-RNA fluorescent quantitative PCR detection.

【Key words】Hepatitis C; Virus; Nucleic acid quantification; Reagent; Detection

丙型肝炎是一個重要的公共衛生問題，是引起慢性肝炎的主要原因之一。目前世界上大約1.7億～2億人感染了丙型肝炎病毒(HCV)，平均感染率為3%[1-2]，在我國，約有3 800萬人感染HCV，多數HCV感染沒有癥狀，少數引起急性肝炎，其癥狀也較乙型肝炎輕[3]。一般成人感染HCV后，約50%～80%發展成慢性丙型肝炎，其中約有20%發展為肝硬化。肝硬化患者每年約有1%～4%發展為肝癌[3]。我國是肝癌的高發地區之一，發病率約為30.3例/10萬，每年約有14萬人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人數的50%以上，肝癌嚴重威脅著人們的健康及生命[4]。因此早期診斷和及時治療尤為重要[4]。目前國內臨床上常用于檢測HCV的方法主要有2類：ELISA法測定HCV抗體(抗-HCV)及PCR檢測血清中HCV RNA含量[5]。近年來，抗-HCV檢測方法雖然有了很大的改進, 但仍然存在一定的局限性：如窗口期過長不利于早期診斷；有約1%～3%的患者抗-HCV可持續陰性，但此類患者的HCV RNA為陽性；抗體的檢出僅代表既往感染且在病毒清除后長時間存在等[5-6]。檢測HCV RNA水平對于評估慢性丙型肝炎的治療效果至關重要，應該采用檢測下限較低的、靈敏度較高的檢測方法[7-8]。本研究選用國內試劑廠家中的2種HCV RNA檢測試劑盒和1種目前國際臨床廣泛應用的HCV RNA檢測試劑盒，對110例慢性丙型肝炎患者血液樣本進行HCV RNA定量檢測，并對檢測結果進行對比分析，探討各試劑提取方法的特點、準確度、靈敏度和臨床應用價值。

對象與方法

一、研究對象

110例慢性丙型肝炎患者血液樣本，取自2014年1月至6月中山大學附屬第三醫院的門診及住院患者，-20℃冰箱保存。其中1例HCV強陽性血清樣本，經中國藥品生物制品檢定所的HCV核酸國家標準品定值，確定濃度為2×106IU/ml。診斷慢性丙型肝炎，主要依據具有慢性肝炎癥狀、體征或病理提示慢性肝炎，同時抗-HCV 和HCV RNA 陽性[9]。

二、主要試劑和儀器

1. 試劑

包括熒光定量PCR試劑盒，A試劑為湖南圣湘生物科技有限公司提供的HCV核酸定量檢測試劑盒(批號2014008，磁珠法)，采用了磁珠法提取病毒核酸，最低檢測限為50 IU/ml；B試劑由中山大學達安基因股份有限公司提供的HCV核酸檢測試劑盒(批號2014005，熒光探針法)，最低檢測限為103IU/ml；C試劑由羅氏公司提供的HCV核酸定量試劑盒(批號123681，內標法)，最低檢測限為15 IU/ml。

2. 儀器

核酸擴增儀：A、B試劑采用美國Applied Biosystem公司的ABI 7300熒光定量PCR儀、C試劑采用羅氏COBAS AmpliPrep儀及Taq Man分析儀。核酸提取儀：A試劑為圣湘公司的NatCH 64自動化核酸提取儀。

三、HCV RNA定量檢測

以陰性血清將HCV強陽性血清10倍梯度稀釋至2.00×105IU/ml、2.00×104IU/ml、2.00×103IU/ml、2.00×102IU/ml。分別用3種試劑對上述樣本及110例臨床樣本進行檢測，方法如下：①試劑A,取出生化專用96孔盤，按試劑盒說明加入磁珠法RNA提取溶液及200 μl待測樣本或陰性對照、陽性對照、定量參考品，然后置于NatCH 64自動化核酸提取儀上，執行相應的程序，程序運行完畢后，取出96孔板，加入50 μl PCR混和反應液，再置于NatCH 64自動化核酸提取儀上進行核酸沖提，最后將已提取核酸全部轉移至0.2 ml PCR反應管中，蓋上管蓋，在ABI 7300熒光定量PCR儀上進行檢測；②試劑B，在0.5 ml離心管中按試劑盒說明書依次加入相應的RNA提取液、100 μl樣本、75%乙醇，離心去上清，打開管蓋，65℃干燥10 min，之后加入逆轉錄PCR反應液進行逆轉錄，將按比例配好的HCV PCR反應液分裝在0.2 ml PCR反應管中，加入5 μl逆轉錄后的樣本上清液5 μl，上機檢測；③試劑C，在樣品管內加入850 μl血漿標本，按照操作步驟設置程序，并把樣品置于COBAS AmpliPrep儀中，結束運行后，轉移至COBAS TaqMan分析儀中。

四、統計學處理

結果

一、3種HCV RNA熒光定量PCR檢測試劑的相關性分析

采用A、B、C 3種試劑對110例臨床血液標本進行檢測，其中3種試劑對58例均有數值，其余52例為其中1種、2種或3種試劑檢測為陰性的樣本。A和B、A和C、B和C間的相關系數分別為0.845、0.917、0.860(P均<0.01)，見圖1。

二、不同HCV RNA載量對試劑檢測結果的影響

A、B、C試劑對58例均陽性樣本的定量結果分別為(4.14±1.88)、(4.35±1.31)、(4.26±1.79)log10IU/ml，比較差異無統計學意義(P>0.05)。但對110例血液樣本的HCV RNA定量檢測結果進行分組統計，在HCV高病毒載量(>106IU/ml)組中，B、C試劑檢出HCV RNA病毒載量較高，A試劑則多定量在105～106IU/ml；在中等病毒載量(103～106IU/ml)組中，不同試劑間差異較少，A、B試劑與C試劑的相關系數分別為0.9248、0.8435(P均<0.01)，A試劑與C試劑相關性更好；在低病毒載量(<103IU/ml)組中，不同試劑檢測結果相差較大。其中C試劑檢測為陰性的結果，A、B試劑檢測均為陰性，表明A、B的特異性與C試劑一致，沒有出現假陽性結果，特異度均為100%；C試劑檢測為50～103IU/ml的29例樣本中，由于A、B試劑的檢測下限，B試劑檢測均為陰性，靈敏度為0%，A試劑有14例樣本檢測結果呈陽性，靈敏度為48.3%。3種試劑的靈敏度比較差異有統計學意義(χ2=58.03，P<0.001)，C試劑靈敏度最高，A試劑次之，B試劑最低，組間兩兩比較差異亦有統計學意義(P均<0.017)。

圖1　3種HCV RNA熒光定量PCR檢測試劑定量檢測的相關性分析結果

A：A試劑與B試劑定量結果散點圖，lgA和lgB相關系數為0.845(P<0.01)；B：A試劑與C試劑定量結果散點圖，lgA和lgC相關系數為0.917(P<0.01)；C：B試劑與C試劑定量結果散點圖，lgB和lgC相關系數為0.860(P<0.01)

表1　3種試劑對110例血清樣本

三、強陽血清樣本及其梯度稀釋樣本定量結果比較

對上述110例樣本中的1例強陽性樣本(經中國藥品生物制品檢定所的HCV核酸國家標準品定值)及其稀釋樣本，用3種試劑分別重復2次檢測，當病毒載量在2.00×103～2.00×106IU/ml時，3種試劑的定量結果與理論值均有很好的相關性與重復性，其檢測濃度的平均值與理論濃度的雙對數線性相關系數分別為0.9983、0.9823、0.9999(P均<0.01)；當病毒載量為2.00×102IU/ml時，C試劑的檢測結果最接近，A試劑次之，B試劑未能檢出，見表2。

表2　3種試劑對強陽性及其梯度

討論

HCV RNA的檢測對于區分HCV感染處于急性期、慢性期或是恢復期至關重要。HCV RNA的定性和定量檢測，是判斷丙型肝炎抗病毒治療效果的重要標準。HCV RNA是病毒復制和肝炎進程的確切標志，測定HCV病毒載量可以監控HCV在體內的復制情況，可為HCV感染者的診斷和療效評價提供重要依據[9]。

本研究中， 3種試劑檢測均有數值的58例樣本進行均值比較和相關性分析，總體結果比較差異無統計學意義。但是如果按病毒載量進行分組比較發現，高病毒載量組中，C試劑陽性例數較多，B試劑次之，A試劑最少，A試劑檢出結果普遍低一個數量級，但就樣本原始的Ct值來看，A試劑定量偏低的樣本，其Ct值比B試劑的檢測結果還小1～2個級別，因此，定量上的偏差，應該大部分來源于試劑各自標準品溯源和定值的問題。中等病毒載量組中，3種試劑結果差異較小，相關性最好，說明在中等病毒載量組中，3種試劑的定量相對而言最穩定，結果最準確。在低病毒載量組中，3種試劑檢測結果相差較大。C試劑檢測為陰性結果的樣本，A、B試劑檢測均為陰性，說明在病毒載量大于103IU/ml的樣本中沒有假陰性結果。C試劑檢測為50～103IU/ml的樣本中，由于A、B試劑的檢測下限，B試劑檢測均為陰性，A試劑有14例樣本檢測結果為陽性。這種假陰性的結果與核酸提取方法容易造成核酸丟失、操作步驟繁多、RNA可能會降解有關，而且病毒載量越低，出現假陰性結果的幾率越高。

本研究選取的3種試劑中，A試劑采用了磁珠分離方法，檢測下限為50 IU/ml。B試劑采用傳統的乙醇沉淀法，檢測下限為103IU/ml。C試劑采用內標法，檢測下限為1.5 IU/ml。A試劑所用的磁珠分離法操作簡單只需按順序加好相應RNA提取液后直接上機，減少交叉污染及操作人員不同引起的差異，相比國外進口的磁珠分離法試劑的價格適中，相比國內采取其他提取方法的試劑檢出下限較低，重復性好。B試劑采取的乙醇沉淀法，操作步驟繁瑣，耗時長，過程涉及煮沸、開蓋，容易造成污染及核酸丟失，最后提取的RNA上清液只取5 μl上機檢測，可能會引起假陰性，重復性不高。C試劑是在COBAS AmpliPrep儀上通過普通硅基俘獲技術進行自動樣品制備。HCV的病毒顆粒在含有蛋白酶和離液序列高的裂解/結合緩沖劑中孵養，通過提高溫度得以裂解，釋放核酸并保護釋放的HCV RNA不受血漿或血清中RNA酶的影響，除了第一步加樣品至樣品管，后續操作步驟均為儀器自動化操作，減少了人為因素和環境因素的影響，是目前國際上廣泛應用于臨床的檢測方法。

從已知濃度的強陽性標本及其稀釋樣本的檢測結果來看，病毒載量為2.00×103～2.00×106IU/ml時，3種試劑的定量結果與理論值均有很好的相關性與重復性。A、C試劑的定量結果與理論值有更好的相關性和重復性，而B試劑對同一標本測出的2次結果差異明顯比A、C試劑大，進一步說明B試劑的提取方法、操作步驟繁瑣，并且都是手工操作，可能造成的結果定值不準、重復性不佳。對于病毒載量為2.00×102IU/ml的樣本，C試劑的檢測靈敏度最高，A試劑次之，B試劑未能檢出。從各自的檢測濃度與理論濃度的雙對數線性相關性比較中可以看出，C試劑最優，A次之，B試劑最差。

臨床上HCV RNA定量對治療具有重要的意義，首先有沒有病毒的復制是確診以及開始治療的關鍵，在治療過程中病毒對藥物的應答如何、病毒復制是否下降、下降幅度等都涉及治療方案的選擇。因此，一個符合臨床要求的試劑應該具有靈敏度高、定量準確、重復性好的優點。本研究顯示，C試劑作為國際上廣泛應用于臨床HCV RNA定量檢測的試劑，優勢明顯。國產A試劑總體性能優于B試劑，核酸獲得率高、操作簡單、兼具高靈敏度與定量準確性，相比國外進口HCV RNA定量試劑較為低廉，對普通丙型肝炎患者而言應該是一種性價比較高的選擇。

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(本文編輯：林燕薇)

臨床研究論著