雞蛋分子檢測技術的研究*

Study on molecular detection ofeggs

梁亦龍**樊　晶　何　睿（重慶郵電大學生物信息學院，重慶　400005）

雞蛋分子檢測技術的研究*

Study on molecular detection ofeggs*

梁亦龍**樊晶何睿
（重慶郵電大學生物信息學院，重慶400005）

**梁亦龍，男，1972年出生，2001年畢業于云南大學生物化學分子生物學專業，碩士，副教授。

蛋白質是人類賴以生存和發展的物質基礎，它不僅是構成細胞的基本有機物，而且是生命活動的主要承擔者，沒有蛋白質就沒有生命。蛋白質的主要來源是肉、蛋、奶和豆類食品，一般而言，動物蛋白品質較高，含有充足的必需氨基酸。必需氨基酸有8種，無法由人體自行合成，必須從食物中攝取。蛋類含蛋白質11%～14%，是優質蛋白質的重要來源。蛋類作為中國居民重要動物性食品之一，其營養豐富，為人類蛋白質的主要來源。蛋中含有優質蛋白質、脂肪、卵磷脂、礦物質、維生素等營養成分，其蛋清中含卵白蛋白，蛋黃蛋白質含量豐富，蛋白質的消化吸收率高，對人體生長十分有益。

雞蛋是人類獲得蛋白質的主要來源之一，其質量安全關系到人體健康，更是關系國計民生的重大問題。雞蛋的質量高低，尤其是蛋品的真偽關系到千家萬戶的飲食安全。近幾年，一些不法商販為了牟取暴利，采用化學試劑人工合成雞蛋，“人造雞蛋”在深圳、杭州等地己相繼被發現，嚴重損害了消費者的健康。研究表明，“人造雞蛋”與真雞蛋蛋殼的主要成分都是碳酸鈣，但是蛋清蛋黃的成分不同，人造雞蛋中主要成分是樹脂、淀粉、凝固劑、色素等化學物質，毫無營養價值且對人體有害。目前國家尚未出臺相關標準檢測真偽雞蛋，消費者僅能憑感覺和經驗識別，無法實現對蛋品真偽的現場技術檢測。湯青萍等對仿土雞蛋的蛋品質分析及變化規律進行了研究，主要集中在蛋白質的含量、蛋黃蛋白比、維生素含量上，沒有提及區分假雞蛋的檢測方法。

分子檢測技術是一種利用現代生物技術水平的檢測技術，具有靈敏度高、選擇性好、特異性強等優點，是新時期食品安全的戰略制高點之一。與常用的毛細管電泳法、光譜法以及各種聯用技術如氣質聯用等法相比，后者雖然靈敏度高、測量結果準確，但是操作復雜、設備價格昂貴、費時費力、不易攜帶、檢測成本高。因此，采用分子檢測技術對市售雞蛋進行分析。結果表明，本方法快速、簡便，為商品檢驗人員對蛋品市場進行廣泛的監測提供科學的手段，為保護消費者權益提供科學依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

雞蛋，購于黃桷埡市場；農村土雞蛋，農戶購買。

電子精密天平，上海奧豪斯公司；DYCZ-24D雙垂直電泳槽；DYY- 6C電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

丙烯酞胺、N- N亞甲基雙丙烯酚胺、三羥基甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉、過硫酸胺、三氯醋酸、考馬斯亮藍250、甲醇、冰醋酸，均為分析純。

1.2試驗方法

1.2.1引物設計

參見卵清蛋白基因設計，上游引物5'GACACAGATAAATAAGGTTGTTCGC- 3'，下游引物5'TTTCTCAGAAGCCATTGATGATGCCACT- 3'，引物由TaKaRa公司合成。

1.2.2卵清蛋白基因PCR擴增

選取7種市售雞蛋，提取雞蛋的基因組DNA。用槍頭取蛋清100 μL于1.5 mL離心管中，加入500 μL核酸裂解緩沖液，混勻后于恒溫箱中65℃反應1 h，期間不時搖勻；在樣品液中加入等體積酚/氯仿（1/1，v/v），混勻，于臺式低溫離心機4℃下12 000 r/min離心5 min；取上清于干凈離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇（1/1，v/v），混勻，于4℃下12 000 r/min離心5 min；取上清于干凈離心管中，加入2倍體積冷的無水乙醇，- 20℃放置過夜，于4℃下12 000 r/min離心5 min，小心去上清，加500 μL 70%乙醇，于4℃下12 000 r/min離心5 min，小心去上清，空氣中晾干，加入200 μL無菌水，充分溶解，DNA溶液保存于- 20℃。以其做模板，用引物擴增卵清蛋白，擴增PCR片段，反應在PE DNA 9600儀器中進行。PCR循環參數：變性階段94℃，5 min；循環階段94℃，1 min，55℃，35 s，72℃，1 min，共30次；復性階段72℃，10 min，凝膠電泳分析。

1.2.3卵黃蛋白的SDS- PAGE電泳

選取7種市售雞蛋，用槍頭取蛋黃100 μL，裂解液提取雞蛋黃蛋白質，BCA法測定蛋白質濃度（生工試劑盒），并進行SDS- PAGE蛋白質電泳，上樣量為20 μg/mL。

1.2.4雞蛋卵磷脂的檢測

卵磷脂在蛋黃中含量較高，通過提取卵磷脂也可檢測雞蛋的成分。取100 μL蛋黃，1 mL冷丙酮，混勻10 000 r/min離心10 min，取沉淀，加入5 mL石油醚和15 mL乙醇，放入燒杯中混合均勻。離心10 000 r/min離心10 min，收集上清。將濾液收集，旋轉蒸發，旋轉蒸發儀溫度設為40℃。收集產品，進行薄層層析檢測。

2　結果與分析

2.1卵清蛋白基因PCR結果與分析

卵清蛋白是動物卵中的貯藏蛋白，給發育中的胚胎提供氨基酸，也是食物中重要的蛋白質來源，對人體健康具有多種改善和提高作用。通過檢測卵清蛋白能進行雞蛋真偽的鑒別。

卵清蛋白基因PCR電泳片段約為520 bp，結果如圖1所示。此片斷經測序后，序列與已登錄的雞卵清蛋白基因序列一致。由圖1可知，市售真雞蛋與農村土雞蛋的卵清蛋白擴增片段一致。由于人造雞蛋主要樹脂、淀粉、凝固劑、色素等化學物質，如果進行DNA提取后，根本無法獲得卵清蛋白基因PCR擴增結果，檢測應該為無電泳條帶。故此圖中未顯示假雞蛋的電泳條帶。

圖1　卵清蛋白PCR擴增圖

2.2卵黃蛋白的SDS- PAGE電泳結果與分析

雞蛋的卵黃中含有大量的蛋白質，每100 g雞蛋含蛋白質12.8 g，蛋黃多居于蛋白的中央，由系帶懸于兩極。蛋黃體積約全蛋的30%~32%，主要組成物質為卵黃磷蛋白，其中含有人體必需的8種氨基酸，并與人體蛋白的組成極為近似，人體對雞蛋蛋白質的吸收率可高達98%。

SDS- PAGE電泳既可分析蛋白質的純度，也可對蛋白質的濃度進行鑒定分析，它在生化物質分析及生物活性物質的分離、制備中和純度鑒定中具有廣泛應用前景。

通過提取雞蛋蛋黃發現，在同樣的體積下，5泳道的蛋白質染色要比2～4泳道的蛋白質染色條帶深，表明其總蛋白質含量農村土雞蛋要大于雞場雞蛋，但其兩者的電泳圖的圖形條帶數量差別不大，結果見圖2。但如果要進行農村土雞蛋與雞場雞蛋的分子鑒定，用該方法不精確，應進一步進行農村母雞和雞場母雞的微衛星序列鑒定分析才能確定，故本試驗中的方法不適合農村土雞蛋和雞場雞蛋的鑒定分析。

圖2　雞蛋蛋黃SDS- PAGE電泳圖

2.3雞蛋卵磷脂的檢測結果與分析

雞蛋卵磷脂也可作為一檢測指標，蛋黃卵磷脂中的主成分是磷脂酰膽堿（PC），卵磷脂是細胞膜的主要組成成分，適量補充卵磷脂有利于細胞的新陳代謝，恢復組織器官的功能，延緩衰老。雞蛋蛋黃卵磷脂薄層圖譜如圖3所示。雞蛋樣品具有卵磷脂，如果是假雞蛋，由樹脂、淀粉等構成，根本不可能有卵磷脂的陽性結果存在，故卵磷脂的薄層層析檢測也可作為鑒別真假雞蛋的方法。

圖3　雞蛋蛋黃卵磷脂薄層圖譜

3　討論

本試驗結果顯示，市售雞場雞蛋與農村土雞蛋都有共同的擴增卵清蛋白基因片段，市售雞場雞蛋與農村土雞蛋的SDS- PAGE凝膠電泳條帶類似，這兩種均可作為分子技術檢測蛋白質的方法。該檢測技術可避免以往單憑感官檢驗的缺陷，可作為一種準確、快速、高效的檢測真假雞蛋的有力措施。而對于市售假雞蛋，這兩種檢測方式都無法獲得陽性結果，即不能通過雞蛋的DNA提取獲得卵清蛋白的基因片段，也不能通過SDS- PAGE凝膠電泳獲得相應的蛋白質條帶。雞蛋的卵磷脂薄層層析圖也顯示，如果是真雞蛋，則會有卵磷脂的存在，可通過薄層層析檢測到陽性結果，否則沒有。雞場雞蛋與農村土雞蛋檢測結果表明，這3種方法都可以作為真假雞蛋的鑒定方法，而農村土雞蛋與雞場雞蛋的區別如果要從分子水平上進行區分，這3種方法都難以進行定量確定?？赏ㄟ^微衛星序列獲得相應農村母雞和農村土雞蛋的微衛星序列進行分析鑒定，進而精確判斷。本試驗研究的3種鑒定方法適用于真假雞蛋的鑒定，如果為真雞蛋，用此3種方法為陽性結果，反之則為陰性結果，該研究可為更好地保護人們的健康和進一步落實食品質量安全市場準入制度提供技術保障。

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LIANGYilong**FANJin HE Rui
（College ofbiological information，Chongqinguniversityofposts and telecommunications，Chongqing 400005，China）

摘要采用PCR方法檢測市售雞蛋的卵清蛋白基因片段，分析市售雞蛋的蛋白質含量及蛋白質電泳圖譜，用薄層層析檢測卵磷脂，以作為區別市售真假雞蛋的鑒別方法，為分子技術鑒別真假雞蛋奠定基礎。

關鍵詞卵清蛋白基因；電泳；蛋黃

AbstractInthepaper,theovalbumingeneweremagnificationbyPCRtoanalysistheprotein contentand protein electrophoreticpatternsofcommerciallyavailableeggs,andlecithinweredetectedbythinlayerchromatography.Thesecanbe used as identification method for distinguishing between true and false eggs and lay the foundation for molecular techniquestoidentifytrueandfalseeggs.

Keywordsovalbumin gene；electrophoresis；yolk

收稿日期：2015- 06- 02

*基金項目：重慶市自然科學基金（CSCT，2009BB1288）；重慶郵電大學創新實驗計劃（2014061，2014062）；重慶市教委項目（KJ130520）。

DOI：10.3969/j.issn.1673- 6044.2015.02.010

文章編號：1673- 6044（2015）02- 0031- 03

文獻標識碼：A

中圖分類號：TS253.7