靶向PDGFR-α mRNA的RNA干擾抑制實驗性增生性玻璃體視網膜病變

孟　竹，彭燕一，秦賢杰

?

·實驗論著·

靶向PDGFR-α mRNA的RNA干擾抑制實驗性增生性玻璃體視網膜病變

孟竹1，彭燕一2，秦賢杰1

Inhibition of targeted platelet-derived growth factor receptor-α RNA interference into vitreous cavity for experimental proliferative vitreoretinopathy

Citation:Meng Z, Peng YY, Qin XJ.Inhibition of targeted platelet-derived growth factor receptor α RNA interference into vitreous cavity for experimental proliferative vitreoretinopathy.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(1):24-27

摘要

目的：觀察血小板源性生長因子-α受體(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR-α)mRNA的RNA干擾抑制實驗性增生性玻璃體視網膜病變(proliferative vitreoretinopathy, PVR)的效果。

方法：選擇PDGFR-α shRNA/lip2000比值1∶1、1∶2、1∶3(其中PDGFR-α shRNA分別為2μg、3μg和4μg)制備復合物轉染至人視網膜色素上皮細胞(human retinal pigment epithelium，HRPE)中，24h后分別取0.1mL注射到家兔玻璃體腔。選取健康成年有色家兔40只隨機分為平衡鹽溶液(balanced salt solution, BSS)組(N組)，含lipofectamineTM2000的HRPE細胞稀釋液組(A組)，取最佳轉染效率的1.0、1.5與2.0μmol/L含PDGF-α受體的shRNA及lipofectamineTM2000的HRPE細胞稀釋液組(B、C和D組)，每組8眼，右眼為實驗眼。間接眼底鏡觀察PVR程度，免疫組織化學染色進行切片著色情況觀察及組織病理學觀察眼底改變。

結果：PDGFR-α shRNA/lip2000比值1∶2時，HRPE細胞最佳轉染效率；B組、C組和D組PVR程度、組織病理學改變、免疫組織化學染色PDGFR-α濃度低于A組，D組比B組和C組更低。

結論：PDGF-α受體mRNA的RNA干擾對實驗性PVR形成有抑制作用。

關鍵詞：視網膜色素上皮細胞；增生性玻璃體視網膜病變；PDGF-α受體；RNA干擾

引用：孟竹，彭燕一，秦賢杰.靶向PDGFR-α mRNA的RNA干擾抑制實驗性增生性玻璃體視網膜病變.國際眼科雜志2016;16(1):24-27

0引言

增生性玻璃體視網膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是在巨大視網膜裂孔、多發視網膜裂孔、眼外傷以及眼內炎癥等因素作用下視網膜或玻璃體表面形成增殖纖維膜繼而收縮、牽拉引起視網膜脫離的一種嚴重眼病。近年來隨著玻璃體手術的普及，各種復雜的視網膜脫離雖然能達到解剖復位，但阻止其再發生卻很難。因此，如何有效診治PVR成為眼科醫生的難題。基因治療是日漸興起的一種行之有效的方法，RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術的日趨成熟完善為PVR提供了基因治療的可能性。目前國內甚少見到靶向血小板源性生長因子-α(platelet-derived growth factor, PDGF-α)受體RNA干擾治療PVR的臨床和實驗報道，因此我們擬構建PDGF-α受體具有轉錄功能的短發卡RNA(shRNA)，觀察其對PVR發生、發展的抑制作用。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物與分組有色體健家兔40只，雄性，無眼疾史，體質量2.0～2.5kg，桂林醫學院實驗動物中心提供。右眼為實驗眼，常規飼養。隨機分為5組，每組8只：N組(正常對照組)玻璃體內注射 0.1mL的平衡鹽溶液(balanced salt solution， BSS)；A組(空白對照組)玻璃體內注射0.1mL含lipofectamineTM2000 HRPE細胞稀釋液的HRPE細胞；B、C、D組(實驗組)玻璃體內分別注射0.1mL的1.0、1.5、2.0μmol/L PDGFR-α shRNA及lipofectamineTM2000 HRPE細胞稀釋液。

1.2方法

1.2.1細胞傳代與培養在37℃、CO2體積分數為5%的培養箱中，HRPE細胞采用加10%血清及1%抗青霉素、鏈霉素的DMEM培養基傳代培養，倒置顯微鏡觀察，細胞貼壁后2d換液，每隔2～3d以2.5g/L胰酶消化、傳代。

1.2.2細胞轉染取對數生長期細胞接種于6孔板中，調整細胞濃度至每孔0.5×106個，待細胞生長至90%以上融合時轉染，具體轉染方法見參考文獻[1]，選取最佳PDGFR-α shRNA/lip2000轉染比值。細胞分為1.0、1.5和2.0μmol/L三個PDGFR-α shRNA濃度組及空白對照組，轉染4～6h后換液，1d后將6孔板置于熒光顯微鏡下觀察，轉染率達60%以上的細胞可用于注射。將上述細胞濃度調整為2.0×106個/mL，分別用一次性1mL無菌注射器取0.1mL HRPE細胞稀釋液于30min內進行玻璃體內注射。

1.2.3動物眼內注射按1.1.1分組中方法注射，氯霉素滴眼液于術前3d滴眼，6次/d；托吡卡胺充分散瞳；愛爾卡因滴眼液滴眼進行眼表面麻醉，在顳上象限角鞏膜緣后4～5mm處用一次性1mL注射器向玻璃體中央刺入，進針深度約為5mm，分別注入不同濃度的HPRE細胞稀釋液或BSS 0.1mL，出針后無菌棉簽按壓針孔5～10s，術后及術后3d用妥布霉素地塞米松滴眼液點眼6次/d，防止感染。分別觀察術后1、2、3、4wk家兔實驗眼玻璃體有無感染、出血等并發癥，若玻璃體內出現絮狀增殖條帶，并且增多發生牽拉，甚至發生視網膜脫離則表明PVR形成。

1.2.4臨床PVR分級觀察用復方托吡卡胺滴眼液充分散瞳后，直接檢眼鏡分別于術前和術后1、2、3、4wk進行檢查，記錄實驗眼PVR的級別，PVRⅢ～Ⅴ級為發生牽拉性視網膜脫離(traction retinal detachment，TRD)，計算TRD發生率。按Fasternburg分級原則將PVR分為5個級別[2]：Ⅰ級：玻璃體內可見增殖條帶；Ⅱ級： 局灶性牽拉等；Ⅲ級：髓線處的局部視網膜脫離及視網膜局部皺褶；Ⅳ級：髓線處視網膜完全脫離，視盤周圍視網膜局部脫離；Ⅴ級：視網膜裂孔形成及全部脫離。

1.2.5 HE染色觀察視網膜病理形態學變化眼內注射后4wk每組在耳緣靜脈注入空氣各處死2只家兔，迅速將眼球取出，于角鞏膜緣環形剪開，流水沖洗，放入4%多聚甲醛溶液固定，乙醇脫水、二甲苯、石蠟包埋，作角膜至視乳頭的連續矢狀切片，石蠟切片脫蠟、水化后，HE染色，光學顯微鏡下觀察病理組織切片染色情況。

1.2.6免疫組織化學觀察PDGF-α的表達用上述方法制作眼球標本，石蠟切片、烤片1h，常規脫蠟、水化，檸檬酸抗原修復液高壓修復，3% H2O2孵育10min，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗3min×3次；棄PBS，滴入兔抗人PDGF-α多克隆抗體(1∶200)，孵育1h，PBS沖洗；滴入二抗，25℃環境下孵育20min，PBS沖洗；DAB顯色，流水充分沖刷，蘇木素復染，封片。光學顯微鏡下分析切片染色情況。

2結果

2.1 HRPE細胞轉染觀察PDGFR-α shRNA與陽性脂質體比值為1∶2(即3μg：6μL)時轉染率高于其他實驗組(圖1①)；PDGFR-α shRNA能被lip2000成功轉染進HRPE細胞(分為1.0、1.5和2.0μmol/L濃度組)，轉染1d后，熒光顯微鏡同一視野下熒光觀察及普通明場觀察細胞內轉染情況，用染核染料統計細胞總數，選取4個視野，計算每一個視野轉染成功的細胞比例，取平均值，計算轉染率為65%～75%(圖1②)。

2.2 PVR分級結果術前各組玻璃體、視網膜結構均正常；A、B、C、D組注射后2～3d，玻璃體內可見明顯的霧狀混濁，眼底隱約可見視網膜位置、顏色正常；7d后霧狀混濁部分消散，并出現灰白色條帶；注射后14d玻璃體內出現不同程度的增粗條索狀物；注射后14～21d，依稀看到條帶狀增殖膜牽拉視網膜微凸出；注射28d后，正常對照組兔眼玻璃體、視網膜結構未見變化；A組兔眼玻璃體內可見大量絮狀物及視網膜脫離，B、C組和D組嚴重度低于A組(圖2)。注入后不同時間點各組PVR分級情況見表1，1wk后，A組形成PVR個數與B、C組和D組均無統計學差異(即均Pb1、Pc1、Pd1>0.05)；注射后2、3、4wk，A組形成PVR個數與B、C組和D組均有統計學差異(均P<0.05)。注射后4wk，B組TRD發生率(50.0%)、C組(37.5%)和D組TRD發生率(25%)與A組(100%)相比，有統計學差異(P=0.04)；D組與B、C組相比，無統計學差異(P>0.05)。

圖1熒光顯微鏡檢查①：質粒與脂質體不同比值時轉染效率(×100，比值為1∶2時轉染率最高)A：1∶1；B：1∶2；C：1∶3。②:轉染率達65%時同一視野下不同視場轉染效果(×200)A：熒光觀察細胞內轉染情況；B：普通明視場觀察細胞內轉染情況。

圖2注射4wk后，N組兔眼玻璃體、視網膜結構正常；空白對照組兔眼玻璃體內可見大量視網膜脫離(箭頭部分)；B、C和D組可見不同程度的絮狀物及視網膜牽拉脫離，嚴重程度低于A組N:正常對照組；A：空白對照組；B：1.0μmol/L PDGFR-α shRNA濃度組；C：1.5μmol/L PDGFR-α shRNA濃度組；D：2.0μmol/L PDGFR-α shRNA濃度組。

圖3HE染色示N組內外核層、神經節細胞排列整齊，全層結構基本正常；空白對照組兔眼視網膜內、外核層細胞排列雜亂，神經節細胞數量減少，外叢狀層消失； B、C組和D組嚴重程度低于A組(×400)N：正常對照組；A：空白對照組；B：1.0μmol/L PDGFR-α shRNA濃度組；C：1.5μmol/L PDGFR-α shRNA濃度組；D：2.0μmol/L PDGFR-α shRNA濃度組。

圖4免疫組化示N組兔眼視網膜神經節細胞隱約可見微量棕黃色PDGF-A陽性顆粒；注射后4wk，空白對照組兔眼視網膜纖維組織可見大量棕黃色PDGF-α陽性表達顆粒；B、C、D組兔眼視網膜纖維組織結構清晰，陽性表達顆粒較A組少，且B、C、D組隨著注入細胞濃度的增加其陽性表達顆粒依次減少(×400)N：正常對照組；A：空白對照組；B：1.0μmol/L PDGFR-α shRNA濃度組；C：1.5μmol/L PDGFR-α shRNA濃度組；D：2.0μmol/L PDGFR-α shRNA濃度組。

2.3視網膜病理形態學變化注射后28d正常對照組兔眼視網膜完整，內外核層、神經節細胞分列有序，全層結構未見明顯變化；A組兔眼視網膜內、外核層細胞排列雜亂，神經節細胞數量減少，外叢狀層消失；B、C組和D組嚴重度低于A組(圖3)。

表1各組各觀察時間點形成PVR個數情況

±s，分)

注：注射后1wk，A組形成PVR個數與B、C和D組均無統計學差異(即Pb1、Pc1、Pd1均>0.05)；注射后2、3、4wk，A組與其他組均有統計學差異(P值均<0.05);A：空白對照組；B：1.0μmol/L PDGFR-α shRNA濃度組；C：1.5μmol/L PDGFR-α shRNA濃度組；D：2.0μmol/L PDGFR-α shRNA濃度組。

2.4免疫組織化學染色結果PDGF-α在視網膜及玻璃體的免疫組織化學染色陽性表現為細胞內棕黃色顆粒，正常對照組兔眼視網膜神經節細胞隱約可見微量棕黃色PDGF-α陽性顆粒；注射后4wk，A組兔眼視網膜纖維組織可見大量棕黃色PDGF-α陽性表達顆粒；B、C、D組兔眼視網膜纖維組織結構清晰，陽性表達顆粒較A組少，且B、C、D組隨著注入細胞濃度的增加其陽性表達顆粒依次減少(圖4)。

3討論

PVR形成的病理過程主要是由于RPE細胞、神經膠質細胞、肌纖維母細胞等在細胞外基質及生長因子的作用下，在PDGF、纖維連接蛋白或由于自分泌的PDGF等血漿中的成分作用下大量增殖、遷移，從而產生惡性循環導致PVR的形成。本次實驗采用PDGF轉染過的HRPE細胞進行兔玻璃體腔注射，術后觀察4wk，即出現顯著的PVR。

PVR動物模型的建立是本次實驗的關鍵，選擇簡易可靠的方法顯得尤為重要。田苗等[2]研究發現通過Dispase和RPE細胞可以成功構建的動物PVR模型，是一種極為便捷可靠的方法。玻璃體注射時進針位置的選定上，選在角鞏膜緣后2～3mm處進針居多，但我們發現這個位置造模成功率低，因為兔眼晶狀體相對較大且呈球形，若從此處進針易損傷晶狀體而發生白內障，以致無法造模成功。本實驗在角鞏膜緣后4～5mm處，沿玻璃體后部進針5mm，減少了對晶狀體損害的同時，直接檢眼鏡觀察對視網膜也無損害，安全穩當。

大量研究證實PDGF與PVR形成關系緊密。司艷芳等[3]研究發現PDGF促進色素上皮細胞的增生和移行，說明PDGF可能對PVR的形成有一定的影響。同時，許迅等[4]研究發現PDGF在PVR患者視網膜中呈較強濃度。并且PDGF只有與其受體結合后，才能發揮相應的生物學作用。因此，阻斷 PDGF受體也能抑制PVR的發展。PDGF受體有α和β兩種，熊蕾等[5]研究發現特異性地阻斷PDGF-α受體的表達比阻斷PDGF-β受體的表達在抑制兔視網膜脫離的形成中更為顯著，提示PDGFR-α與PVR更具關聯性。彭燕一等[6]研究發現PDGF參與了PVR的全過程，同時在眾多因子中被證實是最有前景的一種方法。PDGFR-α在視網膜增生性疾病治療中有可能成為新的研究方向，阻斷 PDGF-α受體的表達可能為治療PVR提供一條新思路。

目前RNAi技術在視網膜增殖性疾病的基因治療方面已獲得了較好的進展[7]。秦賢杰等[8]通過研究證實PDGFR-α shRNA可抑制人視網膜色素上皮細胞增生。周國義等[9]采用向小鼠PVR模型玻璃體腔注射PKCα siRNA的方法，研究其對PVR形成的抑制作用。結果證實，PKCα siRNA對PVR的發生確實有一定的抑制作用。劉矯連[10]通過往小鼠玻璃體腔注入構建慢病毒介導的靶向Netrin-1的小發夾狀RNA，研究表明靶向Netrin-1的shRNA可明顯控制視網膜新生血管形成，為視網膜增殖性病變的基因診治提供了新的方向。目前很多學者已致力于抑制PVR的研究，國外有研究表明，核心蛋白聚糖，一種天然的TGF-β1抑制劑，Nassar等[11]在PVR兔眼模型中應用它輔助玻璃體切割手術，發現可阻礙纖維增殖和視網膜脫離的進展。此外，法舒地爾可通過抑制TGF-β下游的Rho激酶顯著地抑制PVR發展[12]。由此可見，更多抑制PVR發生、發展的臨床研究是不可缺少的。

前已述及PDGF在PVR形成中起著關鍵作用，RPE細胞亦可誘導小鼠PVR模型，同時RNAi技術已較成熟地用于眼科疾病治療中。本研究通過RNAi技術沉默PDGF-α受體，將其注入兔眼玻璃體腔內，免疫熒光檢查顯示PDGFR-α shRNA脂質體成功轉染至RPE細胞內，直接檢眼鏡檢查顯示玻璃體內注射RPE細胞能導致PVR發生，當細胞轉入了PDGFR-α shRNA脂質體時PVR顯著減輕，降低了TRD的發生率，并在一定范圍內隨濃度的增加，病變減輕。免疫組織化學染色結果說明PDGF-α在PVR中高表達，對其RNA進行干擾從而抑制PVR形成，并在一定范圍內隨其濃度增加，抑制作用增強。

綜上所述，PDGF-α受體的RNA干擾對PVR的發生、發展有明顯抑制作用。本次實驗選擇不同濃度梯度，實驗結果顯示，1～2μmol/L的濃度范圍對PVR的抑制程度隨著濃度升高而增強，但是要確定最佳濃度范圍還需進一步的研究，以保證最低的濃度達到最好的抑制效果。然而PDGFR-α shRNA在玻璃體內的應用是否具有視網膜毒性，與PVR的發生是否有一定關聯，尚缺乏實驗研究，有待繼續深層次的研究。本研究針對PDGF-α受體shRNA設計研究PVR的治療方法，為今后臨床基因治療PVR提供良好的實驗基礎。

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Zhu Meng1, Yan-Yi Peng2, Xian-Jie Qin1

Foundation items:Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region (No.2012GXNSFAA053103);the Open Project of Guangxi Medical Scientific Experiment Center (No.KFJJ2011-11)

1Guilin Medical University, Guilin 541004,Guangxi Zhuang Autonomous Region,China;2Department of Ophthalmology, Affiliated Hospital of Guilin Medical University, Guilin 541001,Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Correspondence to:Yan-Yi Peng.Department of Ophthalmology, Affiliated Hospital of Guilin Medical University, Guilin 541001,Guangxi Zhuang Autonomous Region, China.yypeng_7@hotmail.com

Received：2015-09-14Accepted：2015-12-10

Abstract

?AIM:To observe the therapeutic effect of platelet-derived growth factor receptor-α RNA interference on inhibiting experimental proliferative vitreoretinopathy(PVR).

?METHODS:Different concentrations of PDGFR-α shRNA were blended with lip2000,and the final scale of PDGFR-α shRNA/lip2000 complex was 1∶1， 1∶2 and 1∶3 respectively(the concentration of PDGFR-α shRNA was respectively 2μg， 3μg and 4μg)．All the complexes were cultivated in human retinal pigment epithelium(HRPE) for 24h after transfection and then respectively injected 0.1mL to rabbit vitreous cavity．Forty healthy adult rabbits were seleceted in this study and randomly divided into colored balanced salt solution (BSS) group (N), comprising lipofectamineTM2000 HRPE cell dilution group (group A). The highest transduction efficiency of 1.0, 1.5 and 2.0μmol/L containing PDGFR-α receptors shRNA, lipofectamineTM2000 of HRPE cell dilution were selected (respectively group B, C and D) with 8 eyes each, the right eyes as the experimental eye. The extent of PVR was observed by indirect ophthalmoscope;and slice staining situation was observed by immunohistochemistry．The fundus changes were observed by histopathology.

?RESULTS:The highest transduction efficiency of PDGFR-αshRNA/lip2000 ratio was 1∶2.The extent of PVR， the histopathology changes and the immunohistochemistry of PDGFR-α in group B，C and group D were significantly lower than that in group A， while group D was much lower than those of group B and C.

?CONCLUSION:PDGFR-αRNA interference could inhibit the formation of experimental PVR.

KEYWORDS:?retinal pigment epithelium cell;proliferative vitreoretinopathy;platelet-derived growth factor receptor-α;RNA interference

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.1.06

收稿日期：2015-09-14 修回日期： 2015-12-10

通訊作者：彭燕一，教授，主任醫師，研究方向：白內障、眼底病.yypeng_7@hotmail.com

作者簡介：孟竹，女，在讀碩士研究生，研究方向：眼底病。

基金項目：廣西自然科學基金項目(No.2012GXNSFAA053103)；廣西醫學科學實驗中心開放課題項目(No.KFJJ2011-11)
作者單位：`1(541004)中國廣西壯族自治區桂林市，桂林醫學院；`2(541001)中國廣西壯族自治區桂林市，桂林醫學院附屬醫院