大黃酚對青光眼神經(jīng)退行性病變的保護作用及其信號轉(zhuǎn)導通路

胡　浩，江靈莉

作者單位：(317500)中國浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院眼科

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·實驗研究·

大黃酚對青光眼神經(jīng)退行性病變的保護作用及其信號轉(zhuǎn)導通路

胡浩，江靈莉

作者單位：(317500)中國浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院眼科

Citation:Hu H, Jiang LL. Protective effect of chrysophanol on neural degeneration caused by glaucoma and its mechanism.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(1):34-36

摘要

目的：探討大黃酚對慢性青光眼大鼠的保護作用及其作用機制。

方法：采用雙極電凝器電凝鞏膜表面3組靜脈，建立慢性高眼壓大鼠模型，分為3組。一組為高眼壓模型組，一組為大黃酚低劑量組(25mg/kg)，一組為大黃酚高劑量組(50mg/kg)，每組各15只，右眼為實驗眼，左眼為正常對照眼。連續(xù)給藥6wk后處死大鼠并摘取眼球，PCR和Western-blot檢測PERK和ROCK-1在視網(wǎng)膜中的表達。

結(jié)果：大黃酚高、低劑量組能有效降低大鼠眼內(nèi)壓，與模型眼相比有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)。正常對照視網(wǎng)膜p-PERK蛋白水平表達比較低，青光眼模型組表達顯著升高，高、低劑量大黃酚使其表達增高。ROCK-1在視網(wǎng)膜中的表達在青光眼模型組表達最高，各治療組均可使其表達下降，以高劑量組下降最顯著。RT-PCR結(jié)果表明，高劑量組大鼠視網(wǎng)膜PERK mRNA水平明顯高于模型對照眼；ROCK-1 mRNA水平則顯著降低。

結(jié)論：高劑量大黃酚能有效降低青光眼大鼠的眼內(nèi)壓，其作用機制可能是通過激活PERK蛋白磷酸化以調(diào)控PERK/ROCK信號轉(zhuǎn)導而發(fā)揮其保護作用。

關鍵詞：大黃酚；青光眼；PERK；ROCK；神經(jīng)保護

引用：胡浩，江靈莉.大黃酚對青光眼神經(jīng)退行性病變的保護作用及其信號轉(zhuǎn)導通路.國際眼科雜志2016;16(1):34-36

0引言

青光眼是一種復雜的神經(jīng)退行性眼部疾病，它是全球第二大致盲性眼病。青光眼的神經(jīng)性病變發(fā)生在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞及視神經(jīng)軸突，高眼壓是其病變的主要原因之一[1]。眼內(nèi)壓的升高引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞及其軸突漸進性及不可逆轉(zhuǎn)的損失，導致視力喪失。大黃酚是中藥大黃主要的有效單體之一，屬于蒽醌類化合物。研究表明，大黃酚在腦缺血再灌注損傷、阿爾茨海默病中表現(xiàn)出很好的神經(jīng)保護作用[2]。為此，本研究通過考察慢性高眼壓大鼠在大黃酚治療后眼內(nèi)壓的變化，初步探討大黃酚對青光眼治療的可能機制。

1材料和方法

1.1材料PERK和p-PERK多克隆抗體，ROCK-1多克隆抗體(美國Santa公司)，Tono-pen XL筆式眼壓計(美國Mentor)，手術(shù)顯微鏡(上海醫(yī)用光學儀器廠)。SPF級SD雄性大鼠(上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供)45只，體質(zhì)量160～180g，無眼疾。隨機分為3組，一組為高眼壓模型組，一組為大黃酚低劑量組(25mg/kg)，一組為大黃酚高劑量組(50mg/kg)，每組各15只，右眼為實驗眼，左眼為正常對照眼。

1.2方法大鼠3%戊巴比妥鈉溶液按30mg/kg行腹腔注射麻醉，鹽酸奧布卡因進行眼表面麻醉，抗生素注射液滴眼，剪開右眼外眥部，上下眼瞼縫線開瞼，分別于3∶00、6∶00、9∶00及12∶00位處，沿角鞏膜緣剪開球結(jié)膜和其下方的Tenon囊，切口長約2mm，沿切口的兩端行放射狀切開，在直肌旁側(cè)或其下方找到3條鞏膜表層靜脈，用燒灼器迅速輕點燒灼，阻斷成功的標志是血管立即收縮，其遠端血流中斷。術(shù)后結(jié)膜囊內(nèi)點 3g/L諾氟沙星滴眼液。假手術(shù)對照眼只剪開外眥部不燒灼。術(shù)前、術(shù)后即刻及術(shù)后每周用Tono-Pen XL眼壓計測眼壓。建模第3d起高眼壓大黃酚治療組每天灌胃給藥(大黃酚25mg/kg或50mg/kg)，高眼壓模型組每天灌胃等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉。到6wk末，用100g/L水合氯醛溶液按3mL/kg的劑量腹腔麻醉，隨后摘取每只鼠的雙眼，去除其眼球前節(jié)。在無菌條件于顯微鏡下將眼球做成眼杯，小心剝離出視網(wǎng)膜組織，液氮下冷凍，-80℃儲存。

1.2.1 RT-PCR技術(shù)檢測視網(wǎng)膜組織中基因表達采用RT-PCR技術(shù)檢測各組大鼠視網(wǎng)膜組織中PERK 和 ROCK-1的mRNA表達。首先使用Trizol試劑盒從視網(wǎng)膜組織中提取總mRNA，然后將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，同時進行實時熒光定量PCR檢測。PCR反應參數(shù)為：95℃ 3min，循環(huán)體：95℃ 30s， 55℃ 30s，72℃ 30s，35～40個循環(huán)，延伸：72℃ 15min。GAPDH引物序列：上游5’-GACATCAAGAAGGTGGTGAAGC-3’，下游 5’-TGTCATTGAGAGCAATGCCAGC-3’；PERK引物序列：上游5’-AAGATGGTACAGTGGACGGC-3’，下游5’-CCGTGTTCCTGGTGAAATCT-3’;ROCK-1引物序列：上游5’-CCCTCACCACTTTCCAGCCA-3’，下游5’-GGCGGTGGCTTAAAAACATGC-3’。以PERK mRNA、ROCK-1 mRNA與GAPDH mRNA含量比值作為PERK mRNA、ROCK-1 mRNA表達水平。

1.2.2 Western-blot檢測視網(wǎng)膜組織中蛋白表達取各樣本蛋白質(zhì)50μg進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉2h，TBST液洗膜3次，每次5min，共3次，加入相對應的特異性一抗孵育，ROCK-1多克隆抗體的工作濃度為1∶500，PERK和p-PERK多克隆抗體的工作濃度都為1∶1000。4℃孵育過夜。TBST液洗膜3次，每次5min，然后二抗室溫孵育2h，TBST液洗膜3次，每次5min，共3次，ECL曝光后采用Quantity-one Software 4.6.9測定各條帶光密度。

2結(jié)果

2.1高眼壓大鼠模型的眼壓觀察大鼠術(shù)前右眼和左眼眼壓差異無統(tǒng)計學意義(15.87±1.87vs16.02±2.02mmHg，t=0.5233，P=0.6031)。在實驗過程中，對照組眼壓在14～17mmHg范圍波動。高眼壓模型眼(右眼)眼壓相對于對照眼明顯升高(16.42±2.18vs21.81±2.92mmHg，t=6.770，P=0.0045)。在連續(xù)給藥6wk后，大黃酚高、低劑量組大鼠眼內(nèi)壓平均下降了31%和22%(圖1)。

圖1各組大鼠不同時間點眼內(nèi)壓變化情況Sham：假手術(shù)組；Model：模型組；25mg/kg：25mg/kg大黃酚灌胃組；50mg/kg：50mg/kg大黃酚灌胃組;bP<0.01，dP<0.001vsSham組；aP<0.05，fP<0.01vsModel組。

圖2大鼠視網(wǎng)膜中mRNA表達水平A：各組大鼠視網(wǎng)膜ROCK-1信使RNA表達水平；B：各組大鼠視網(wǎng)膜PERK信使RNA表達水平；Sham：假手術(shù)組；Model：模型組；25mg/kg：25mg/kg大黃酚灌胃組；50mg/kg：50mg/kg大黃酚灌胃組。aP<0.05，bP<0.01vsSham組；cP<0.05，dP<0.01vsModel組。

2.2各組大鼠視網(wǎng)膜中PERK和ROCK基因的表達量以PERK/GAPDH和ROCK/GAPDH比值代表PERK和ROCK mRNA的相對表達情況。由圖2可見，高眼壓模型大鼠視網(wǎng)膜ROCK-1和PERK mRNA表達水平較正常對照眼視網(wǎng)膜水平顯著升高(t=0.0008，P=0.0008；t=4.415，P=0.0116)。大鼠大黃酚灌胃6wk后，在低劑量組和高劑量大鼠視網(wǎng)膜PERK mRNA與高眼壓模型對照組相比都上升(t=3.388，P=0.0276；t=6.944，P=0.0023)。而ROCK-1 mRNA相對表達量較高眼壓視網(wǎng)膜相比都顯著下降(t= 3.034，P=0.0383；t=5.162，P=0.0067)。

圖3大鼠視網(wǎng)膜蛋白表達水平A：各組大鼠視網(wǎng)膜ROCK-1、PERK、p-PERK蛋白表達條帶；B：各組大鼠視網(wǎng)膜ROCK-1蛋白表達水平；C：各組大鼠視網(wǎng)膜PERK蛋白表達水平；D：各組大鼠視網(wǎng)膜p-PERK蛋白表達水平；Sham：假手術(shù)組；Model：模型組；25mg/kg：25mg/kg大黃酚灌胃組；50mg/kg：50mg/kg大黃酚灌胃組。aP<0.05，bP<0.01vsSham組；cP<0.05，dP<0.01vsModel組。

2.3視網(wǎng)膜中PERK/ROCK信號通路作用抑制為了探討大黃酚對高眼壓大鼠治療的作用機制，采用Western-blot檢測大鼠視網(wǎng)膜中p-PERK、PERK和ROCK-1的蛋白水平(圖3)。結(jié)果表明，相對于正常對照眼視網(wǎng)膜，高眼壓模型組中p-PERK蛋白表達水平顯著增加(t=2.951，P=0.0419)， 并且PERK蛋白表達也增加，但無統(tǒng)計學差異(t=1.624，P=0.2029)。同時，ROCK-1蛋白表達也大大上升(t=7.167，P=0.0056)。在給藥6wk后，與高眼壓模型相比，高低劑量組大鼠視網(wǎng)膜p-PERK蛋白(t=4.935，P=0.0078；t=1.025，P=0.413)和PERK蛋白(t=5.171，P=0.0066；t=2.106，P=0.103)都呈上升趨勢，而ROCK-1蛋白表達卻下降(t=5.971，P=0.004；t=4.603，P=0.012)。

3討論

青光眼是具有病理性高眼壓合并視盤、視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層損害及青光眼視野改變的一種致盲性眼病，而高眼壓是其病變的主要原因，其特征表現(xiàn)為視神經(jīng)萎縮和視野缺損。視神經(jīng)損傷是青光眼發(fā)病的一個重要因素，而視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡是青光眼神經(jīng)病變的最終通路[3]。蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKR-like ER kinase，PERK)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡的一個重要途徑，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的凋亡信號傳導通路是細胞凋亡信號傳導三大通路之一[4]。細胞凋亡促成青光眼神經(jīng)節(jié)細胞的丟失，而青光眼視網(wǎng)膜損傷的主要病理變化之一就是神經(jīng)節(jié)細胞的減少。Rho相關蛋白激酶(Rho associated kinase，ROCK)的主要功能是調(diào)節(jié)細胞肌動蛋白骨架的重組，從而廣泛參與神經(jīng)再生、細胞凋亡等一系列神經(jīng)保護作用。最近，研究表明ROCK抑制劑能引起眼壓下降和房水外流增加，在保護視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞、降低眼內(nèi)壓以及改善眼部血流量等方面為青光眼的治療提供了一個新的良好前景，并且其對于青光眼濾過性手術(shù)后瘢痕的形成也有減輕效果[5]。

大黃酚是從廖科植物大黃中提取的主要有效成分之一，研究表明大黃酚具有止咳、抗菌、止血作用，并能促進腸管動物的神經(jīng)興奮和肌肉麻痹。它對于腦缺血再灌注小鼠腦中過氧化氫酶活性有增強作用，其具有明顯的抗衰老作用[6]。對于衰老小鼠的記憶障礙，大黃酚能增加腦組織超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性，改善被動回避性記憶障礙[7]。近年來，大黃酚對于神經(jīng)保護作用的研究越來越多。為此，本研究首次嘗試探討大黃酚對于視網(wǎng)膜的神經(jīng)保護作用。

本研究通過構(gòu)建經(jīng)典的慢性眼壓大鼠模型，通過測定眼內(nèi)壓來判斷高眼壓大鼠模型的構(gòu)建情況。大鼠青光眼模型構(gòu)建成功后，我們進一步考察了大黃酚對青光眼大鼠的保護作用，并探討了大黃酚對青光眼保護的可能分子機制。實驗結(jié)果表明，高眼壓大鼠在大黃酚灌胃給藥6wk后，眼內(nèi)壓明顯降低，提示其對于青光眼有一定的治療效果。大鼠視網(wǎng)膜PERK蛋白磷酸化比例顯著升高，相同的，ROCK-1蛋白的表達在高眼壓大鼠視網(wǎng)膜中表達也明顯增加，提示PERK蛋白磷酸化以及ROCK蛋白在青光眼的發(fā)病機制中發(fā)揮重要的作用。同時，mRNA結(jié)果也顯示出相同的趨勢，PERK和ROCK-1兩者的mRNA表達水平在模型大鼠視網(wǎng)膜中也顯著上升。由此我們可以推測，大黃酚可通過降低眼內(nèi)壓治療青光眼，其機制之一可能是通過調(diào)控PERK/ROCK信號通路。最近，研究還表明青光眼引起的視神經(jīng)萎縮，在眼壓得到控制后仍有神經(jīng)細胞的調(diào)亡、視功能的損害，說明高眼壓不是視功能損害的唯一原因。視神經(jīng)的血液供應和神經(jīng)營養(yǎng)因子的補充也是影響青光眼治療的重要原因。王樹等[8]發(fā)現(xiàn)大黃酚對于腦缺血再灌注小鼠有一定的保護作用，它能提高大鼠腦內(nèi)的血流量。由于視神經(jīng)的血液供應與大腦血管都來自頸內(nèi)動脈，大黃酚或許也能通過改善大鼠大腦血液供應從而增加視神經(jīng)的血液供應來發(fā)揮其治療青光眼的作用。除此之外，宋金艷等證實了大黃酚脂質(zhì)體能提高腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的表達，而BDNF保護視神經(jīng)功能作用在體內(nèi)、體外青光眼模型得到許多證實[9]。關于大黃酚對青光眼大鼠保護作用的詳細機制有待深入探討。

參考文獻

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Protective effect of chrysophanol on neural degeneration caused by glaucoma and its mechanism

Hao Hu, Ling-Li Jiang

Department of Ophthalmology, the First People’s Hospital of Wenling, Wenling 317500, Zhejiang Province, China

Correspondence to:Hao Hu. Department of Ophthalmology, the First People’s Hospital of Wenling, Wenling 317500, Zhejiang Province, China. huhao06@126.com

Received：2015-08-19Accepted：2015-12-14

Abstract

?AIM:To investigate the effect and mechanism of chrysophanol for rat model with glaucoma.

?METHODS:The glaucoma rat models were made by cauterization of three episcleral veins. Then the glaucoma rats were divided into three groups. Group 1 was the untreated intraocular hypertension group. Group 2 was the low dose of chrysophanol group (25mg/kg). Group 3 was the high dose of chrysophanol group (50mg/kg), 15 rats in each group. The right eyes were the experiment eyes while the left were the control ones. After 6wk treatment, the mRNA and protein of protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) and Rho kinase 1 (ROCK-1) were determined in the retina.

?RESULTS:The chrysophanol reduced intraocular pressure (IOP) of experiment eyes, which was significantly lower than that of control eyes (P<0.01). Compared with the normal group, the p-PERK protein increased significantly in the retina of glaucoma model group and chrysophanol increased the lever of p-PERK protein. The ROCK-1 protein level increased significantly in glaucoma group, it all decreased in these treatment groups, and it decreased significantly in high dose treatment group. Detected by TR-PCR, chrysophanol also could activate the mRNA of PERK and inhibited the mRNA expression of ROCK-1 in a rat model of glaucoma.

?CONCLUSION:These results suggest that chrysophanol can reduce the IOP through the phosphorylation of PERK protein to regulate the PERK/ROCK signaling in glaucoma rat model.

KEYWORDS:?chrysophanol;glaucoma;protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase;Rho kinase 1;neuroprotection

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.1.08

收稿日期：2015-08-19 修回日期： 2015-12-14

通訊作者：胡浩.huhao06@126.com

作者簡介：胡浩，畢業(yè)于溫州醫(yī)科大學，副主任醫(yī)師，研究方向：白內(nèi)障、青光眼、眼視光學。