鏈霉菌Da07210抗菌活性物質發酵優化分析

朱軍 馮鳳兆 劉敏 鮑時翔 孫前光 黃惠琴

摘 要 鏈霉菌Da07210能產生對香蕉枯萎病病原菌有強烈抑制作用的活性物質。采用單因子實驗和正交試驗對其發酵條件進行優化。優化后的發酵培養基為：葡萄糖1.0%、甘油1.0%、大豆粉1.5%、硫酸銨0.5%。優化后的培養條件為：初始pH值7.0、培養溫度28 ℃、種齡48 h、接種量8%、培養時間144 h、搖床轉速200 r/min。

關鍵詞 鏈霉菌；抗菌活性物質；發酵

中圖分類號：S482.2 文獻標志碼：B 文章編號：1673-890X（2015）36--02

香蕉鐮刀菌枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴專化型（Fusarium oxysporum f.sp. cubense，FOC）引起的維管束壞死的系統性病害，嚴重影響了香蕉的生產和發展[1]。目前，尚未有效防治該病的方法[2]。國外關于香蕉枯萎病生物防治的研究主要集中于香蕉枯萎病拮抗菌的篩選及其室內盆栽防治試驗。因此，篩選FOC拮抗菌株，開發新型農用抗生素對香蕉鐮刀菌枯萎病的防治具有重要的意義。

大多數抗生素是由放線菌產生的。放線菌Da07210是從海南省鸚哥嶺原始森林土壤中分離到得一株放線菌。通過多項分類，確定菌株Da07210隸屬鏈霉菌屬（Streptomyces）。該菌株的發酵產物能抑制包括FOC在內的多種土傳真菌病害的病原菌，如辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）等。因此，Streptomyces sp.Da07210可以作為有潛在開發價值的抗生素產生菌。本文就其發酵條件進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

放線菌Da07210分離自海南省鸚哥嶺原始森林土壤中。

1.1.2 測試菌株

古巴尖孢鐮刀菌4號生理小種分離自海南省澄邁縣發病蕉園。

1.1.3 培養基

用于抑菌活性測定指示菌培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基；斜面培養基：高氏一號合成培養基，蒸餾水配制，pH7.2～7.4；種子培養基（1 000 mL）：葡萄糖10.0 g，可溶性淀粉5.0 g，酵母膏10.0 g，大豆粉10.0 g，磷酸二氫鉀0.5 g，pH7.2。發酵基礎培養基（1 000 mL）：葡萄糖5.0 g，大豆粉10.0 g，磷酸二氫鉀0.5 g，pH7.2。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養

菌種活化：將保存的菌株Da07210接種于斜面培養基，28 ℃培養5 d。種子液培養：挑取活化的菌種接入裝有50 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，200 r/min、28 ℃下振蕩培養3 d作為種子液；搖瓶培養：取10 mL種子液接入裝有100 mL培養基的500 mL三角瓶中，28 ℃、200 r/min下恒溫振蕩培養4 d。發酵液離心收集上清用于抑菌活性測定和物理化學特性實驗。

1.2.2 抗菌活性物質的生物測定

以古巴尖孢鐮刀菌4號生理小種為指示菌，用紙片擴散法進行抗菌活性物質的生物測定[3]。

1.2.3 發酵培養基優化

首先采用單因子試驗，對碳源、氮源進行優化，然后在單因子試驗的基礎上用正交設計實驗[4]對發酵培養基做進一步優化。

1.2.4 發酵培養條件優化

用經過優化的發酵培養基，分別對不同發酵溫度、pH值、接種量、搖瓶裝量、搖床轉速、種齡及發酵時間進行搖瓶發酵，測定發酵液抑菌活性，確定最佳發酵條件。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基優化

2.1.1 碳源的優化

在其他成分不變基礎上，改變碳源的種類，分別以葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、甘油、可溶性淀粉作為碳源進行單因素實驗，取0.5%、1.0%、1.5%這3個濃度水平，每個處理重復3次，測定發酵液抗菌活性。結果表明，菌株Da07210以葡萄糖、甘油為碳源，當2種碳源濃度達到1.0%時，發酵液抑菌活性最好（見表1）。

2.1.2 氮源的優化

在氮源濃度一定（1%）的前提下，分別添加大豆粉、玉米粉、蛋白胨、酵母粉、硫酸銨為氮源進行單因素實驗，取0.5%、1.0%、1.5%和2.0%這4個濃度水平，每個處理重復3次，測定發酵液抑菌活性。菌株Da07210當大豆粉濃度為1.5%，硫酸銨濃度為1.0%時，抑菌圈直徑達到最大值（見表2）。

2.1.3 碳氮源正交優化實驗

根據單因素實驗結果，菌株Da07210以甘油、葡萄糖、硫酸銨、大豆粉作為碳氮源，采用L9（34）正交表進行碳氮源配比優化實驗，每個處理重復3次。實驗結果見表3。結果表明，碳氮源對菌株Da07210合成活性物質的影響順序為：葡萄糖>甘油>大豆粉>硫酸銨；最佳碳氮源濃度為：葡萄糖1.0%，甘油1.0%，大豆粉1.5%，硫酸銨0.5%。

2.2 發酵條件優化

2.2.1 溫度對產活性物質的影響

采用優化發酵培養基，不改變其他發酵條件，確定22、24、26、28、30 ℃5個溫度水平，每個處理重復3次，測定發酵液抑菌圈活性。結果表明，當在28 ℃培養時抑菌圈直徑最大，而溫度過高或過低抑菌圈直徑均減小。

2.2.2 起始pH對產活性物質的影響

采用優化發酵培養基，將培養基初始pH值分別調節為4、5、6、7、8，每個處理重復3次，進行搖瓶發酵，檢測菌株Da07210抗菌效果。結果表明，pH值為7.0時發酵液的抑菌圈直徑最大。

2.2.3 接種量對產活性物質的影響

在優化發酵培養基中，分別按裝液量的4%、6%、8%、10%、12%接入培養了48 h的種子液，每個處理重復3次，測定發酵液抑菌圈活性。結果表明，菌株Da07210以8%的接種量最佳。

2.2.4 搖床轉速對產活性物質的影響

采用優化發酵培養基，搖床轉速設定為50、100、150、200、250 r/min5個梯度，接種量均為10%，每個處理重復3次，測定發酵液抑菌圈活性。實驗結果表明，Da07210在轉速為200～250 r/mi時，活性最好且變化不明顯。

2.2.5 種齡對產活性物質的影響

在優化發酵培養基中，以10%的接種量分別接種培養時間為24、36、48、60、72 h的搖瓶種子，每個處理重復3次，進行搖瓶發酵，測定發酵液抑菌圈活性。菌株Da07210種子液培養48 h，接種后對應的發酵液抑菌圈直徑最大。

2.2.6 發酵時間對產活性物質的影響

采用優化發酵培養基，其他條件不變，分別發酵48、72、96、120、144、168 h，每個處理重復3次，測定發酵液抑菌圈活性。菌株Da07210發酵至144 h時活性達到最大。

3 討論

Streptomyces sp. Da07210的發酵產物對多種多種土傳真菌病害的病原菌都有拮抗作用，因此具有成為抗生素產生菌的開發潛力。本實驗得到該菌株的最佳發酵培養基和發酵條件，為Streptomyces sp. Da07210進一步的工業開發利用提供了數據基礎。

參考文獻

[1]Ploetz R C. Fusarium Wilt of Banana is Caused by Several Pathogens Referred to As Fusarium oxysporum f. sp. cubense [J].Phytopathology，2006（96）：653–656.

[2]Ploetz R C， Pegg K. Fusarium wilt. In Diseases of Banana [M].Abacá and Enset. Jones D R （Ed.）. Wallingford，UK： CAB International，1999，143-159.

[3]Hunfeld K P， Weigand J， Wichelhaus T A. In vitro Activity of Mezlocillin Meropenem Aztreonam， Vancomycin， Teicoplanin， Ribostamycin and Fusidic Acid Against Borrelia burgdorferi[J].International Journal of Antimicrobial Agents，2001（17）：203-208.

[4]杜榮騫.生物統計學[M].第2版.北京：高等教育出版社，2003：275.

（責任編輯：趙中正）