BAPTA-AM脂質體抗大鼠重癥急性胰腺炎的作用

BAPTA-AM脂質體抗大鼠重癥急性胰腺炎的作用

宋必衛，鄭彩云，俞巧麗

(浙江工業大學 藥學院，浙江 杭州 310014)

摘要：為觀察BAPTA-AM脂質體(BA-L)抗重癥急性胰腺炎(SAP)的作用，采用胰膽管逆行注射4%牛黃膽酸鈉(TC)制作大鼠SAP模型.BA-L治療組于造模后立即尾靜脈注射相應劑量BA-L，給藥24 h后，觀察各組大鼠的死亡情況，檢測各組大鼠血清AMS，LDH，TNF-α水平以及胰腺組織勻漿MDA水平及SOD活性，HE染色觀察胰腺組織病理學改變.結果表明：給予BA-L治療后SAP大鼠死亡率明顯降低，血清AMS，LDH，TNF-α水平和胰腺組織勻漿MDA水平顯著降低，SOD活性增高，HE染色組織切片顯示BA-L明顯減輕胰腺組織損傷.表明BA-L能顯著減輕大鼠SAP，為開發BA-L成臨床SAP治療新藥物提供必要的藥效學依據.

關鍵詞：BAPTA-AM；急性胰腺炎；Ca`(2+)；TNF-α

收稿日期：2015-04-17

作者簡介：宋必衛(1956—)，男，安徽岳西人，教授，研究方向為神經分子藥理學，E-mail:bwsong@zjut.edu.cn.

中圖分類號：R965

文獻標志碼：A

文章編號：1006-4303(2015)05-0562-05

Abstract:To explore the protective effect of BAPTA-AM liposome (BA-L) on severe acute pancreatitis (SAP), a rat SAP model was established by retrograde injection of 4% sodium taurocholate (TC) into pancreatic duct. After modeling, BA-L groups were immediately administered BA-L in different doses. After 24 h of BA-L administration, the mortality of rats, serum AMS, LDH and TNF-α levels, tissue MDA and SOD levels were detected. Pathological changes of pancreatic tissue were examined. The results show that BA-L could significantly reduce the mortality compared to the modeling. A comparison of the modeling groups shows that the AMS, LDH, TNF-α and MDA levels of the BA-L group were reduced remarkably, however, the SOD activity was increased significantly. These changes were also associated with parallel changes in histopathological appearance. In conclusion: The results above demonstrated that BA-L can exert an admirable protection against TC induced SAP in rats. The study also provides the essential therapeutic basis for BA-L to be developed as an anti-SAP drug.

Keywords:BAPTA-AM; acute pancreatitis; Ca`(2+); TNF-α

Protective effect of BAPTA-AM liposome on severe acute pancreatitis in rats

SONG Biwei, ZHENG Caiyun, YU Qiaoli

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

急性胰腺炎是臨床較為多見的急腹癥之一，是由多種病因引發的胰酶在胰腺內部被異常激活后，繼發胰腺組織自身消化、水腫、出血甚至壞死的一系列炎癥反應.其發病率呈逐年上升趨勢，大部分急性胰腺炎患者病情具有自限性，預后良好；但有20%～30%的患者可進展為重癥急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis，SAP)，SAP可引發全身炎癥反應綜合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，以致多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，甚至是多器官功能衰竭(Multiple system organ failure，MSOF)，從而導致死亡[1-2].目前，臨床SAP治療效果差，仍缺乏針對發病因素、能很好保護胰腺細胞特效治療藥物，SAP病死率仍然高達10%～30%[3].SAP的發病機制極其復雜，誘因諸多，如膽道疾病、內分泌與代謝障礙、大量飲酒與暴飲暴食、胰管阻塞、藥物、手術創傷等[4].目前認為腺泡細胞Ca2+超載、溶酶體水解酶特別是組織蛋白酶B釋放、微循環障礙致缺血缺氧-再灌注損傷、TNF-α等炎癥因子釋放，是SAP發生發展的主要分子機制[5].

Ca2+作為細胞內重要的第二信使，在胰腺腺泡細胞的生理與病理過程中起重要作用，細胞內Ca2+超載是造成SAP的一個重要因素[6-7].BAPTA[1,2-bis(o-aminophenoxy)ethane-N,N,-Nc,Nc-tetraaceticacid;1,2,雙-鄰氨苯氧乙烷基-N,N,-Nc,Nc-四乙酸]是目前國際上實驗室常用的Ca2+絡合劑，其乙酰氧甲基化物(BAPTA-AM)極易進入細胞，在細胞內被酯酶水解后釋放BAPTA，消除細胞內Ca2+超載，調節鈣穩態[8].本課題組通過大量的研究發現：BAPTA-AM對正常人肝細胞(L-02)、人肝癌細胞(HepG-2)、犬腎小管細胞(MDCK)和神經細胞等細胞具有很好的保護作用，能大幅度降低細胞死亡，提高細胞存活率[9-11]；整體實驗研究已證明BAPTA-AM脂質體(BAPTA-AM liposome，BA-L)對小鼠急性肝衰竭、大鼠急性腎損傷都有良好的治療作用[12-13].以此為依據，本研究通過建立實驗性大鼠SAP模型，觀察BA-L抗SAP的作用及機制.

1材料與方法

1.1藥品與試劑

BA-L(粒徑125～130 nm)合肥恒星科技開發有限公司提供；牛黃膽酸鈉(Sodium taurocholate，TC)，批號101388587，購自美國Sigma公司；腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor alpha，TNF-α)ELISA試劑盒，批號24010981024，由武漢博士德生物工程有限公司提供；淀粉酶(Amylase，AMS)試劑盒，批號20141210，乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒，批號20141211，超氧化物歧化酶(Superoxide dismutese，SOD)試劑盒，批號20141208，考馬斯亮藍試劑盒，批號20141212，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)試劑盒，批號20141211，均由南京建成生物工程研究所提供.

1.2實驗動物

采用清潔級健康SD雄性大鼠，體重約220～250 g，購自浙江省醫學科學院動物中心.動物許可證號：scxk(浙)20140001.

1.3分組與給藥

隨機將大鼠分為正常組(control)，偽手術組(sham)，模型組(model)，BA-L分3個劑量給藥組(劑量分別為98，140，200 μg/kg)，每組8只(不包含死亡率檢測).SAP造模后，給藥組立即尾靜脈注射(按0.05 mL/kg的容積給藥)相應劑量BA-L，正常組、偽手術組和模型組分別尾靜脈注射等體積的生理鹽水.

1.4大鼠SAP模型的制備

大鼠實驗前12 h禁食不禁水，用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，依照Aho和郝建志等的方法復制SAP模型[14-15]：腹部剃毛消毒后，于劍突下正中切開2 cm開腹.進腹沿著胃向下1～2 cm處找到十二指腸系膜緣處的胰腺，胰腺中間可見透明胰管.用手食指托起中段十二指腸，找到腸管壁內潛在的十二指腸大乳頭，用注射針頭于十二指腸外側壁無血管區域扎一個小孔，再用膽管插管從小孔進入腸管后再沿著乳頭方向探入膽胰管內，并與膽胰管呈平行方向平行推入1 cm，再用無創血管鑷夾住固定，同時在肝門下的肝管匯合處，用另一無創血管鑷夾閉肝總管.以勻速緩慢注入4%牛黃膽酸鈉溶液(1 mL/kg)，隨即可見胰腺呈彌漫性紅腫.滯留5 min后拔去膽管插管，松開無創血管鑷，消毒針口后逐層縫合關腹.偽手術組不注射4%牛黃膽酸鈉溶液，僅作開腹及做針頭穿刺動作.

1.5大鼠血液和組織樣本的采集

給藥后24 h，通過腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，經左頸總動脈取血.血液用離心機3 000 r/min離心10 min獲取血清，分裝于Eppendorf管-20 ℃冷凍保存，用于血清AMS，LDH，TNF-α檢測.取血后立即取胰腺組織，用4 ℃的生理鹽水洗去表面血液，取胰腺組織的尾部以PH值為7.2±0.1的PBS為介質，制備10%的組織勻漿，按試劑盒操作步驟檢測MDA水平和SOD活性.

1.6胰腺組織的病理學改變

取同一部位胰腺組織，置于10%的福爾馬林溶液固定至少24 h以上，常規石蠟包埋，制成厚度為4 μm的切片，用乙醇梯度脫水，二甲苯透明，最后HE染色.依照Rongione等[16]的標準，在200 倍光鏡下觀察胰腺組織病理學改變，隨機選取8個視野，從組織水腫、炎癥浸潤、細胞壞死、出血四個方面的損傷輕重程度，進行組織病理評分.

1.7統計學分析

實驗數據采用Graphpad Prism 5.0軟件處理，數據用Mean±S.E.M表示，除特別說明之外，其余實驗數據均采用One way ANOVA檢驗均數顯著性差異，以P<0.05為有顯著性差異.

2結果

2.1BA-L對SAP大鼠死亡率的影響

SAP大鼠死亡率(24 h)見表1，采用Chi-square test檢驗均數顯著性差異，偽手術組與正常對照組均無大鼠死亡，而模型組死亡率高達37.5%，給藥組除了低劑量組有1例死亡外，中劑量和高劑量均無大鼠死亡.提示BA-L可降低SAP大鼠死亡率.

表1　BA-L降低SAP大鼠(24 h)死亡率 1)

注：1) 與模型組比較，*P<0.05.

2.2BA-L降低SAP大鼠血清AMS活性和LDH水平

SAP的特異性血清AMS活性和非特異性LDH水平見圖1和圖2，與正常組比較，偽手術組指標無顯著差異；模型組血清AMS活性和LDH水平均顯著性升高(P<0.001)，提示大鼠胰腺損傷明顯.不同劑量的BA-L給藥組血清AMS均極其顯著降低(P<0.001)，當劑量為140 μg/kg時，效果最佳，進一步加大劑量為200 μg/kg則無進一步降低趨勢.BA-L在140 μg/kg劑量時，抑制SAP引起LDH釋放(P<0.01)的效果最明顯，SAP引起的LDH釋放為各組實驗值減去正常組均值.

與正常組比較， ###P<0.001；與模型組比較， ***P<0.001 圖1　BA-L降低SAP大鼠血清AMS活性 Fig.1　BA-L lowered the serum activities of AMS in rats with SAP

與模型組比較， *P<0.05， **P<0.01 圖2　BA-L抑制SAP引起的LDH釋放 Fig.2　BA-L inhibited LDH release induced by SAP

2.3BA-L減輕SAP大鼠胰腺組織氧化損傷

胰腺組織MDA水平、SOD活性測定結果見表2，模型組MDA水平顯著增高(P<0.001)，同時SOD活性明顯降低(P<0.001).BA-L治療顯著降低MDA水平(P<0.001)，恢復SOD活性.結果顯示：模型組MDA水平顯著上升，同時SOD活性降低，提示氧化損傷參與了SAP的發病過程；BA-L可抗氧化損傷，起保護胰腺的作用，并存在一定的劑量依賴性趨勢.

表2　BA-L抗SAP大鼠胰腺組織勻漿氧化

注：1) 與正常組比較，###P<0.001；與模型組比較，**P<0.01，***P<0.001.

2.4BA-L改善SAP大鼠胰腺病理學變化

綜合以上實驗的結果，選取BA-L 140 μg/kg劑量組的胰腺組織進行HE染色，200倍光鏡下隨機選擇8個視野觀察大鼠胰腺組織病理學變化(圖3)，按組織壞死、出血、炎癥、水腫4個方面進行病理學評分.圖3(a,b)胰腺結構清晰，形態完整，間質無滲出，無明顯的炎癥滲出，無出血與壞死.圖3(c)結構模糊不清，胰閏管和小葉間導管極顯著擴張，胰腺間質明顯水腫，炎癥細胞浸潤，小葉有大量彌漫性出血及壞死.圖3(d)與模型組相比，胰腺結構清晰，病變明顯減輕，可見小葉間水腫，少量炎癥細胞浸潤，個別有出血及壞死現象.病理學評分(表3)可見：模型組得分相比正常對照組明顯增高，胰腺損傷程度很重；BA-L治療組的得分顯著減低，表明損傷較輕.

表3　大鼠胰腺組織損傷病理學評分(HE染色)

注：1) 與正常組比較，###P<0.001；與模型組比較，***P<0.001.

圖3　BA-L改善SAP大鼠胰腺組織病理學變化 Fig.3　BA-L ameliorated the injury of pancreatic tissue

2.5BA-L降低血清TNF-ɑ水平

1.1 對象 2011年1—6月在我科住院且使用靜脈留置針的老年患者300例，按住院號的單雙分為實驗組和對照組各150例，兩組患者性別、年齡、文化程度、病種、靜脈條件和用藥情況比較差異無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

血清TNF-ɑ水平見圖4.模型組水平是正常組的4倍以上(P<0.001)；與模型組比較，BA-L各給藥組TNF-ɑ表達水平均極明顯下降；當BA-L劑量為140 μg/kg時，TNF-ɑ表達水平降低尤為明顯.

與正常組比較， ###P<0.001；與模型組比較， ***P<0.001 圖4　BA-L降低SAP大鼠血清TNF-α水平 Fig.4　BA-L decreased the serum levels of TNF-α in rats with SAP

3討論

多種誘因均可導致SAP，如膽源性、酒精性及高脂血癥等，目前沒有特效的治療方法.當SAP發生時，常伴有血鈣降低，提示SAP時胰腺損傷與Ca2+水平異常有關.近年來，Ca2+在SAP病理生理學過程中的作用研究是SAP領域研究焦點之一，細胞內Ca2+超載被普遍認為是導致胰腺腺泡細胞死亡的關鍵因素[17].Wittel等[18]的研究顯示在大鼠SAP模型中，腺泡細胞內Ca2+濃度升高，可導致胰腺水腫和壞死.Dante等[19]動態觀察了胰腺組織中的Ca2+濃度的變化，發現在SAP的早期，胰腺組織中就有Ca2+的異常聚集，并且隨著疾病的發展而加重.這是由于在多種致病因素的相互作用下，破壞了細胞膜的完整性，細胞外的Ca2+可以通過異常開放的Ca2+通道流入細胞內，從而造成胰腺腺泡細胞內Ca2+超載.體外實驗也證實SAP時細胞內Ca2+持續升高，且與SAP 的嚴重度正相關[20].Mooren等[21]分別結扎了大鼠和小鼠的胰管造成SAP模型，測得胰腺細胞內Ca2+明顯升高，細胞內鈣穩態遭到破壞.腹腔給與鈣絡合劑預處理，可抑制大SAP模型鼠胰腺細胞內Ca2+升高，證實細胞內Ca2+信號變化直接參與了SAP的發生發展.BAPTA-AM是極易進入細胞的Ca2+絡合劑，在胞內被酯酶水解后釋放BAPTA，消除細胞內Ca2+超載，達到調節鈣穩態的目的.本實驗采用逆行胰膽管注射4%牛黃膽酸鈉建立大鼠SAP模型，探索BAPTA-AM抗SAP的作用.

胰腺是一個有內、外分泌功能的重要器官，它的生理和病理變化都與生命息息相關.AMS主要由唾液腺和胰腺分泌.其功能主要是能分解多糖，如淀粉和糖原.血清AMS升高最多見于SAP.當SAP發生時，AMS升高，臨床上一般都用AMS作為重癥急性胰腺炎診斷的首選指標.LDH是細胞破裂的非特異標志物，在胰腺損傷過程中釋放[22].MDA是自由基引發的脂質過氧化過程中合成的醛類物質，其含量高低反映了機體內氧化損傷程度.SOD可通過清除體內氧自由基，發揮抗氧化作用來保護細胞.TNF-α是造成胰腺損傷的主要炎癥因子，是胰腺炎癥事件中最早起作用的因素之一.TNF-α與TNF受體結合，激活死亡受體通路，分別能引起胰腺細胞和毛細血管內皮細胞細胞凋亡、程序性壞死，并通過激活NF-κB通路引起炎癥反應[23-24].本實驗中，正常組和偽手術組AMS活性、TNF-α水平、氧化應激指標以及組織形態學特征幾乎未見異常，表明實驗手術過程未對胰腺造成任何損傷.SAP模型組中血清AMS，LDH活性和TNF-α水平急劇增高、嚴重的氧化損傷及形態學特征變化等表明了動物模型的成功.給予BA-L治療后大鼠各項指標水平明顯降低，表明BA-L具有胰腺保護作用，并能顯著減輕SAP大鼠胰腺損傷，其作用機制可能與抗氧化損傷、減少TNF-α表達有關，開發前景良好.

4結論

研究首次證明BA-L靜脈注射給藥，能顯著減輕SAP大鼠胰腺損傷.在劑量為140 μg/kg時效果最佳，單次給藥療效可維持24 h以上，證明BA-L有良好的抗SAP功效.BA-L抗SAP機制可能與抗氧化損傷，減少TNF-α表達有關.實驗給藥時間是在SAP大鼠造模成功后，屬于治療用藥，故實驗結果比一般的預防用藥更符合臨床的治療實際，為BA-L開發成SAP治療藥物提供了一條全新思路.

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(責任編輯：劉巖)