視網膜色素上皮細胞吞噬功能與MERTK-Ras-肌球蛋白通路關系的研究

孫昱昭，張若霜，谷　峰

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·實驗論著·

視網膜色素上皮細胞吞噬功能與MERTK-Ras-肌球蛋白通路關系的研究

孫昱昭，張若霜，谷峰

Study on relation between the phagocytic fuction of retinal pigment epithelial cells and MERTK-Ras-myosin signal pathway

Citation:Sun YZ, Zhang RS, Gu F. Study on relation between the phagocytic fuction of retinal pigment epithelial cells and MERTK-Ras-myosin signal pathway.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(1):28-33

摘要

目的:研究視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞吞噬功能與MERTK受體及其下游信號通路Ras-MEK-MLCK-肌球蛋白的關系。

方法：用視細胞外節膜盤(rod outer segments，ROS)于37℃孵育離體培養的3～5代C57小鼠RPE細胞，在孵育0、30、60、120、180、240min終止吞噬反應。雙重熒光標記法檢測RPE細胞吞噬動力學；以MERTK及Ras抗體、磷酸化MEK及MLCK抗體應用Western-Blot方法檢測不同孵育時間(30、60、120、180min)MERTK、Ras、MEK及MLCK的激活狀態；以瞬時轉染質粒方法抑制Ras及MERTK基因表達后，再次以Western-Blot方法檢測對應時間MERTK-Ras通路激活狀態及吞噬功能的變化。

結果：C57小鼠RPE細胞吞入ROS發生在孵育30min，并在3h達到飽和。在吞噬過程中，隨著孵育時間的延長，RPE細胞MERTK、Ras、MEK和MLCK的蛋白表達水平不斷增多(與對照組相比，P<0.05)。Ras及MERTK干擾后的RPE細胞與ROS共孵育(30、60、120、180min)的全過程中，MERTK、Ras、MEK和MLCK的蛋白表達及ROS的吞入數量始終維持較低水平，僅在孵育180min見到少量ROS吞入；與未轉染RPE細胞相比，siRas-RPE細胞及siMERTK-RPE細胞與ROS共孵育120、180min時，MERTK、Ras、MEK及MLCK的蛋白表達量均明顯減少(P<0.05)。

結論：Ras-MEK-MLCK-肌球蛋白通路是鼠RPE細胞吞噬過程中MERTK受體激活的下游信號通路。

關鍵詞：視網膜色素上皮；吞噬；MERTK；Ras；肌球蛋白

引用：孫昱昭，張若霜，谷峰.視網膜色素上皮細胞吞噬功能與MERTK-Ras-肌球蛋白通路關系的研究.國際眼科雜志2016;16(1):28-33

0引言

研究表明視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞吞噬功能障礙是視網膜色素變性的病因，但目前對RPE細胞吞噬功能的確切機制尚不清楚。以往對RPE細胞吞噬功能的研究表明，RPE細胞對視細胞外節膜盤(rod outer segments，ROS)的吞噬是受體介導的特異性吞噬過程，分為結合、攝入及消化三個不同的時相[1]；而MERTK被認為是啟動RPE細胞吞噬ROS過程的受體分子[2]，并可與RPE細胞表面唯一的整合素受體分子αvβ5通過磷酸化黏著斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)發生“crosstalk”促進吞噬[3]。但是，RPE細胞吞噬過程中MERTK所啟動的確切下游信號目前仍不清楚。已知MERTK介導的巨噬細胞對凋亡細胞的吞噬激活了蛋白激酶C(PKCβⅡ)，并通過調節肌動蛋白(actin)的分布形成吞噬杯來吞噬凋亡的細胞[4]；然而RPE細胞吞噬ROS的過程中MERTK并不直接作用于actin，而是通過靶向作用于非肌性肌球蛋白myosinⅡ來形成吞噬杯以完成對ROS的吞入過程的[5]。但是MERTK通過哪種信號通路來靶向作用于肌球蛋白myosin，目前尚未見明確報道。

MERTK受體是一種受體酪氨酸激酶[6]，具有受體和激酶的雙重功能，參與細胞內信號轉導。與MERTK相關的信號通路比較復雜，目前已知的Ras-MAPK途徑是生長因子、細胞因子及整合素等所共有的信號通路[7]。有研究表明，尿激酶-血纖維蛋白溶酶原激活物(U-PA)可以通過選擇性地整合素受體分子αvβ5，經由Ras-MEK(extracellular signal regulated kinase kinase，胞外信號調節激酶的激酶)-ERK(extracellular signal regulated kinase，胞外信號調節激酶)-MLCK(myosin light chain kinase，肌球蛋白輕鏈激酶)通路激活myosin來刺激細胞的遷移[8]。也有研究表明，抗高血壓藥物卡托普利也通過Ras-MEK-MLCK通路作用于腸系膜動脈的myosin來降低血壓[9]，這提示我們，RPE細胞吞噬過程中MERTK受體后通路可能涉及Ras-MEK-MLCK-myosin途徑。為此，本研究擬探討RPE細胞是否通過MERTK受體介導的Ras-MEK-MLCK信號通路來發揮吞噬ROS的功能，為RPE細胞吞噬功能的調控及臨床治療視網膜色素變性提供新的思路。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物C57BL/6小鼠，7～10周齡，體質量20～22g，購自中國醫科大學實驗動物部。小鼠飼養環境：清潔級小動物實驗房(恒溫：25℃；濕度：40%～50%；光照：8 h/d)。

1.1.2試劑DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)培養液及Hanks液(美國Gibco公司)，胰蛋白酶(美國Difco公司)，胎牛血清(FCS，天津TBD公司)，Fluro-3/AM(美國Sigma公司)，fluorescein isothiocyanate(異硫氰酸熒光素，FITC)及sulforhodamine(硫酰羅達明，SR，美國Invitrogen-Molecular Probe公司)，蔗糖及Tris(氨丁三醇)(中國聯星公司)，SYBR Green Real-Time PCR KIT(TaKaRa公司)，RIPA裂解液及BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，MERTK抗體(德國Acris antibodies公司)，Ras、MEK、MLCK抗體(Cell signal technology)，限制性內切酶(加拿大Fermetas公司)，高純質粒制備試劑 (北京百泰克生物技術有限公司)，Lipo2000(美國Invitrogen公司)。Olympus-IX71倒置顯微鏡(日本Olympus公司)及Diagnostic instruments-spot insigh熒光數字圖象采集攝像系統(美國DI公司)。Exicycler 96熒光定量PCR儀(韓國BIONEER)。凝膠成像分析儀(北京六一WD-9413B)。雙垂直蛋白電泳儀(北京六一DYCZ-24DN)。

1.2方法

1.2.1 RPE細胞培養采用胰蛋白酶消化法[2]，每次取4只C57BL/6鼠，麻醉后剜除眼球，剪除角膜、去除晶狀體后將眼杯置于0.2%胰酶中消化50min，吹打、離心收集后以含有20%小牛血清、1%青鏈霉素及1%非必需氨基酸、1% L-谷氨酸的DMEM培養液中培養，融合后傳代。第3～5代細胞用于實驗。采用Cytokeratin-8進行RPE細胞鑒定，Cytokeratin-8免疫染色陽性細胞為RPE細胞。

1.2.2 ROS提取及染色根據Papermaster等[10]的方法并有所改動提取ROS，簡言之：將人視網膜神經層懸于340g/L蔗糖勻漿液中，劇烈搖動1min后，以4 000r/min離心4min，收集上清，并加入二倍于其體積的10mmol/L Tris-HCl緩沖液，然后以4 000r/min離心4min，收集沉淀，加入不連續密度梯度液的頂層，27 000r/min離心30min。將提取的ROS中加入終濃度為10mg/L FITC液，室溫下，于暗處孵育1h以標記ROS。

1.2.3吞噬檢測采用雙重熒光標記法進行吞噬動力學檢測及計數[11]，吞噬動力學檢測的時間點設定為0、30、60、120、180、240min。用于吞噬動力學檢測的RPE細胞種植在35mm培養皿上。

1.2.4吞噬過程中MERTK-Ras-MEK-MLCK-myosin通路激活狀態測定采用Western-Blot方法：將RPE細胞與ROS孵育不同時間后[0min(即為對照組)、30、60、120、180min]，吸出ROS孵育液，并用4℃ Hanks液沖洗細胞2次，終止吞噬反應，然后加入100μL RIPA裂解液裂解細胞、離心獲得抽提蛋白。用BCA測定試劑盒測定上清蛋白濃度后，-80℃保存備用。各時間點蛋白樣品量為60μg。制備5%濃縮膠及濃度為8%、10%、13%的分離膠。加入上樣液20μL及5μL蛋白Marker，電壓80V，恒壓電泳2.5h。以電壓70V轉印1.5h將凝膠轉印至PVDF膜上。將轉好的PVDF膜放入5% TBS+脫脂奶粉的封閉液中室溫封閉1h。分別加入稀釋的MERTK抗體(1∶250)、Ras抗體及磷酸化MEK、MLCK抗體(1∶500)4℃孵育過夜，洗脫后加入1∶5000稀釋的二抗37℃孵育45min，再次洗脫，ECL發光。以β-actin為內參，用Gel-Pro Analyzer圖像分析軟件對結果進行灰度分析，計算目的蛋白的相對表達量(目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值)，明確MERTK-Ras-MEK-MLCK-myosin通路激活狀態。

1.2.5 Ras及MERTK干擾及干擾后MERTK-Ras-MEK-MLCK-myosin通路激活狀態測定構建高純度質粒后行細胞轉染以干擾Ras/MERTK基因表達。

圖1RPE細胞形態及鑒定A：原代RPE細胞的融合圖像(倒置顯微鏡，×100)；B：3～5代RPE細胞的80%

融合圖像(倒置顯微鏡，×100)；C：細胞RPE細胞均表現為Cytokeratin-8免疫染色陽性(倒置熒光顯微鏡，×400)。

1.2.5.1質粒構建分別設計3個干擾片段，位點分別為Ras-245、Ras-509、Ras-601，對應序列分別為245-GAGCGCCTTGACGATACAG，509-GGACTCTGAAGATGTGCCT，601-GGAGTTACGGGATTCCGTT及Mertk-431，Mertk-1316，Mertk-1528，對應序列分別為431-GATGGAAAGGAATTGCTCG，1316-AGCGCAGGGACTTACAAAG， 1528-CACCGACTCTATGTTCATC。對pRNA-H1.1質粒進行雙酶切并與目的基因連接后加入至100μL JM109感受態細胞中培養、提取質粒，鑒定及篩選陽性克隆，標記為Ras-sh1，Ras-sh2，Ras-sh3，MERTK-sh1，MERTK-sh2，MERTK-sh3，測序。

1.2.5.2細胞轉染配制轉染試劑：溶液1：100μL優化液+8μL脂質體2000；溶液2：100μL優化液+2μg質粒，將溶液1與溶液2混勻，室溫下放置20min后緩慢加入RPE細胞培養板中，搖動培養板混勻，37℃、5% CO2培養6h。棄去轉染培養基上清，更換為細胞完全培養液，37℃、5% CO2繼續培養24h后收集細胞以SYBR Green Real-Time PCR KIT檢測Ras/MERTK基因表達情況，Ras基因引物分別為：5’-TTGTGGATGAGTATGACCCTA-3’及5’-CTCCTCTTGACCTGCTGTGT-3’，MERTK基因引物分別為：5’-CCTGGCAACACCGACTCTA-3’及5’-TTTACGACCAGTTGGGAATC-3’，內參β-actin基因引物分別為5’-CTGTGCCCATCTACGAGGGCTAT-3’及5’-TTTGATGTCACGCACGATTTCC-3’。選擇干擾效果最佳的片段進行正式實驗。

1.2.5.3干擾后MERTK-Ras-MEK-MLCK-myosin通路激活狀態測定及吞噬功能檢測將siRas-RPE細胞及si-MERTK-RPE細胞與ROS孵育不同時間后[0min(即為對照組)、30、60、120、180min]采用Western-Blot方法檢測MERTK、Ras、MEK及MLCK的蛋白表達情況，并比較孵育120min及180min時未轉染RPE細胞、siRas-RPE細胞及si-MERTK-RPE細胞中MERTK、Ras、MEK及MLCK的蛋白表達；采用雙重熒光標記法測定siRas-RPE細胞及siMERTK-RPE細胞的吞噬功能的變化。

統計學分析：每步實驗重復3次，結果以 SPSS 17.0軟件進行重復測量方差分析及單因素方差分析進行統計，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 C57BL/6小鼠RPE細胞的培養及鑒定原代RPE細胞胞漿內可見棕褐色色素顆粒，細胞呈多邊形，3～5代RPE細胞透明，無色素，呈梭形。Cytokeratin-8免疫染色后可見全部RPE細胞均呈現陽性綠色熒光，提示培養細胞為RPE細胞(圖1)。

圖2不同孵育時間RPE細胞結合及吞入ROS數量。

圖3Western-Blot檢測RPE細胞與ROS孵育不同時間MERTK、Ras、MEK、MLCK表達的變化A：PVDF膜掃描圖像顯示孵育不同時間MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白的表達；B：孵育不同時間MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白相對表達量的比較。

2.2吞噬檢測結果雙重熒光標記方法檢測RPE吞噬ROS的結果顯示，在孵育30min時可見ROS被RPE吞入胞漿內，隨著孵育時間的延長結合及吞入的ROS數量不斷增加，至孵育3h時，結合及吞入的ROS數量達到飽和(圖2)。

圖4Ras基因干擾后RPE細胞Ras基因及蛋白表達的變化A：Real-time PCR檢測Ras基因干擾后RPE細胞Ras基因表達的變化(以2-△△Ct均值表示)；B：Western-Blot檢測Ras基因干擾后RPE細胞Ras蛋白表達的變化；C：Real-time PCR檢測MERTK基因干擾后RPE細胞MERTK基因表達的變化(以2-△△Ct均值表示)；D：Western-Blot檢測MERTK基因干擾后RPE細胞MERTK蛋白表達的變化；Control：正常REP細胞；NC：空載體轉染組；siRAS：Ras基因干擾組；siMERTK：MERTK基因干擾組；aP<0.05vsControl組、NC組。

2.3吞噬過程中MERTK-Ras-MEK-MLCK-myosin通路激活狀態測定將3～5代RPE細胞與ROS共同孵育不同時間(30、60、120、180min)后，Western-Blot檢測相關蛋白的表達變化，結果顯示RPE細胞與ROS共同孵育30min時，與對照組(0min)相比，MERTK、MEK和MLCK的磷酸化水平升高，Ras蛋白表達量增加，并且隨著孵育時間的延長MERTK、MEK和MLCK的磷酸化水平與Ras表達量均不斷增多(P<0.05，圖3)。

2.4 Ras/MERTK干擾及干擾后MERTK-Ras-MEK-MLCK-myosin通路激活狀態測定三個不同片段構建的質粒進行小鼠RPE細胞瞬時轉染Ras/MERTK后，Real-time PCR檢測結果顯示Ras-sh3(即Ras-601)及MERTK-sh3(即MERTK-1528)干擾效果最佳。以Ras-sh3及MERTK-sh3瞬時轉染后測定RPE細胞Ras及MERTK基因及蛋白表達均較未轉染組明顯降低(P<0.05，圖4)。

以Ras-sh3片段構建的質粒重新進行小鼠RPE細胞瞬時轉染Ras后，將siRNA-Ras的RPE細胞與ROS孵育不同時間[0min(即為對照組)、30、60、120、180min]，再次采用Western-Blot方法檢測MERTK、Ras、MEK及MLCK的蛋白表達，結果顯示MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白的表達水平均與對照組(0min)無顯著差異(P>0.05)，即在全部孵育過程中MERTK、Ras、MEK、MLCK的蛋白始終維持在較低的表達水平(圖5A第1～5條帶)；同時，與未轉染的RPE細胞相比，siRas-RPE細胞與ROS共孵育120、180min時，MERTK、MEK、MLCK的磷酸化水平及Ras蛋白表達量均明顯下調(P<0.05，圖5A第6～9條帶)。

以MERTK-sh3片段構建的質粒重新進行小鼠RPE細胞瞬時轉染Ras后，將siMERTK-RPE細胞與ROS孵育不同時間[0min(即對照組)、30、60、120、180min]，再次采用Western-Blot方法檢測MERTK、Ras、MEK及MLCK的蛋白表達，結果顯示在全部孵育過程中MERTK、Ras、MEK、MLCK的蛋白始終維持在較低的表達水平(P>0.01，圖6第1～5條帶)；同時，與未轉染的RPE細胞相比，siMERTK-RPE細胞與ROS共孵育120、180min時，MERTK及Ras、MEK、MLCK的蛋白表達量均減少(圖6A第6～9條帶，P<0.05)，但其蛋白表達的下降幅度并沒有siRas-RPE細胞大。

siRas-RPE細胞及siMERTK-RPE細胞的吞噬數量的變化：分別將siRas-RPE細胞及siMERTK-RPE細胞與ROS孵育不同時間(30、60、120、180、240min)后，再次進行吞噬數量測定，結果顯示siRas-RPE細胞結合ROS的數量隨孵育時間延長逐漸增加，而吞入ROS的數量極少，僅在孵育180min時可觀察到少量ROS吞入了RPE細胞內。圖6Western-blot檢測siMERTK-RPE細胞與ROS孵育不同時間MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白表達的變化A：Western-Blot檢測掃描圖像，從左至右:1～5顯示對照組及siMERTK-RPE細胞與ROS孵育30、60、120、180min MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白表達的變化；6、7分別為未轉染RPE細胞及siMERTK-RPE細胞與ROS孵育120min MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白表達的變化；8、9分別為未轉染RPE細胞及siMERTK-RPE細胞與ROS孵育180min MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白表達的變化；β-actin基因為內參；B：siMERTK-RPE細胞與ROS孵育不同時間MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白相對表達量的變化；C:RPE細胞及siMERTK-RPE細胞與ROS孵育120min及180min MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白相對表達量的比較。

圖5Western-Blot檢測siRas-RPE細胞與ROS孵育不同時間MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白表達的變化A：Western-Blot檢測掃描圖像，從左至右:1～5顯示對照組及siRas-RPE細胞與ROS孵育30、60、120、180min MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白表達的變化；6、7分別為未轉染RPE細胞及siRas-RPE細胞與ROS孵育120min MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白表達的變化；8、9分別為未轉染RPE細胞及siRas-RPE細胞與ROS孵育180min MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白表達的變化；β-actin基因為內參；B：siRas-RPE細胞與ROS孵育不同時間MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白相對表達量的變化；C：RPE細胞及siRas-RPE細胞與ROS孵育120min及180min MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白相對表達量的比較。

比較RPE細胞和siRas-RPE細胞與ROS結合與吞入ROS的數量，可見孵育各時間點結合數量無明顯變化，而吞入ROS的數量減少了97%(孵育180min時，圖7)。siMERTK-RPE細胞結合ROS的數量隨孵育時間延長逐漸增加，而未見吞入ROS(圖7)。

3討論

與受體酪氨酸激酶(RTK)相關的信號通路比較復雜，目前已知的下游信號通路分為Ras-MAPK、PI3K-Akt、PLCγ-IP3/DG三種，這三條通路涉及了許多的細胞功能，如增殖、分化、遷移以及凋亡功能[12-13]，其中的Ras-MAPK途徑是生長因子、細胞因子及整合素等所共有的信號通路。RTK與腺體結合后激活，激活的RTK與生長因子結合蛋白-2(Grb2)結合，Grb2實際上是一種結合蛋白，它含有一個SH2和兩個SH3域，SH2可與RTK結合，SH3可與GEF(guanine exchange factor，鳥嘌呤交換因子)結合，這樣就形成了RTK-Grb2-GEF復合體，該復合體在GEF的作用下將Ras激活，進而通過逐級反應激活MEK及MLCK，從而活化肌球蛋白myosin，即RTK-Grb2-Ras-MEK-MLCK-myosin通路。近年來的研究證實，人RPE細胞吞噬ROS過程中也是通過受體酪氨酸激酶MERTK與細胞內蛋白的SH2域結合后來啟動細胞骨架重排及細胞膜運動的[14]。但是RPE細胞吞噬ROS過程中MERTK磷酸化激活后是否啟動了下游的Ras-MEK-MLCK-MLC通路目前尚未見報道。

圖7不同孵育時間RPE、siRas-RPE及siMERTK-RPE細胞及結合及吞入ROS數量比較。

本研究在離體條件下模擬RPE細胞吞噬ROS的條件，并檢測了吞噬動力學及吞噬過程中MERTK、Ras、MEK、MLCK的變化情況，結果發現在孵育30min時可見ROS被RPE吞入胞漿內，隨著孵育時間的延長吞噬數量不斷增加，至孵育3h，吞噬數量達到飽和；同時，在孵育過程中，隨著孵育時間的延長，MERTK、Ras、MEK及MLCK的蛋白表達水平不斷增加，這種吞噬動力學與蛋白表達的變化趨勢的一致性提示，吞噬過程中MERTK與ROS結合后激活了下游的Ras信號通路。

為了進一步證實這一假設，本研究組采用RNA干擾技術將RPE細胞的Ras基因沉默后，再次進行孵育實驗并測定吞噬變化及吞噬過程中MERTK、Ras、MEK及MLCK的變化情況，結果發現：在孵育過程中，隨著孵育時間的延長，siRas-RPE細胞結合ROS的數量明顯增加，而吞入ROS的數量極少，僅在孵育180min時可觀察到少量ROS吞入了RPE細胞內。與RPE細胞相比，siRas-RPE細胞結合ROS的數量無明顯變化，而吞入ROS的數量下降了97%(圖7)。同時，隨著孵育時間的延長，MERTK、Ras、MEK及MLCK的蛋白表達水平維持低值且不隨孵育時間延長而變化(灰度比值均<0.5)。比較孵育120min及180min后正常RPE細胞與siRas-RPE細胞MERTK、Ras、MEK及MLCK蛋白表達水平，更可清晰地看到siRas-RPE細胞MERTK、Ras、MEK及MLCK蛋白表達水平的明顯下降。siRas-RPE細胞吞噬動力學與MERTK、Ras、MEK及MLCK蛋白表達水平的一致變化，提示RPE細胞吞噬ROS過程是通過啟動MERTK-Ras-MEK-MLCK通路來重排肌球蛋白來完成的。

另一方面，本研究發現，正常RPE細胞孵育過程中隨著孵育時間的延長，RPE細胞結合及吞入ROS的數量不斷增加，同時MERTK蛋白的表達水平也隨著孵育時間的延長而增加；而siRas-RPE細胞孵育過程中隨著孵育時間的延長結合ROS的數量逐漸增加，但吞入ROS數量極少，并且MERTK蛋白的表達水平也未隨著孵育時間的延長而增加，siRas-RPE細胞的這種變化趨勢與MERTK基因突變的RCS鼠相似：RCS鼠由于MERTK基因突變而表達無功能的MERTK蛋白，所以雖然可以結合ROS但是卻存在攝入ROS的明顯異常[5]，從而發生視網膜色素變性。這就從另一角度提示Ras可能為MERTK啟動的下游信號這一結論。至于Ras干擾后MERTK蛋白表達水平降低的原因尚待進一步研究，分析可能的原因應與受體酪氨酸蛋白激酶各個復雜的下游通路之間的相互作用有關[15]。

為了明確RCS鼠是否因MERTK異常而無法啟動下游的Ras信號通路，從而進一步證實RPE細胞吞噬過程中MERTK-Ras信號通路的存在，本研究用質粒轉染技術沉默RPE細胞的MERTK基因來模擬RCS鼠的RPE細胞狀態，再次進行孵育實驗并測定吞噬變化及吞噬過程中MERTK、Ras、MEK及MLCK的變化情況，結果發現，在全部孵育過程中siMERTK-RPE細胞MERTK、Ras、MEK、MLCK的蛋白始終維持在較低的表達水平(灰度比值均<0.5)，比較孵育120min及180min后正常RPE細胞與siMERTK-RPE細胞MERTK、Ras、MEK及MLCK蛋白表達水平，也可看到siMERTK-RPE細胞MERTK、Ras、MEK及MLCK蛋白表達水平的降低。這與siRas-RPE細胞孵育過程中MERTK、Ras、MEK、MLCK的蛋白表達變化保持一致，證實Ras確為MERTK啟動的下游信號。

當然，本研究采用的是質粒瞬時轉染技術干擾Ras及MERTK基因及蛋白的表達，雖然進行了多個序列篩選、采用效果最佳的序列進行轉染，但仍不能完全沉默Ras及MERTK基因及蛋白的表達(圖3)，加上目前檢測蛋白表達的免疫印跡方法也只能通過灰度比值這一相對數值來評估，所以研究結果存在無法避免的誤差。

但是，無論如何本研究初步探討了鼠RPE細胞吞噬功能與MERTK-Ras-MEK-MLCK通路的關系，發現正常鼠RPE細胞在吞噬ROS過程中MERTK、Ras、MEK及MLCK蛋白表達增加(灰度比值>0.5)，而干擾了MERTK及Ras基因表達后RPE細胞在吞噬ROS過程中MERTK、Ras、 MEK及MLCK蛋白表達維持在較低水平，且不隨孵育時間延長而增加(灰度比值均<0.5)，從而證實RPE細胞通過受體酪氨酸激酶MERTK激活下游Ras、MEK及MLCK通路，引起肌球蛋白重排完成吞噬功能，進一步闡明了RPE細胞吞噬機制，為今后視網膜色素變性的治療提供了新的靶點。

參考文獻

1 Mayerson PL, Hall MO.Rat retinal pigment epithelial cells show specificity of phagocytosisinvitro.JCellBiology1986;103(1):299-308

2 Feng W, Yasumura D, Matthes MT,etal. Mertk triggers uptake of photoreceptor outer segments during phagocytosis by cultured retinal pigment epithelial cells.JBiolChem2002;277(19):17016-17022

3 Nandrot EF, Silva KE, Scelfo C,etal. Retinal pigment epithelial cells use a MerTK-dependent mechanism to limit the phagocytic particle binding activity of αvβ5 integrin.BiolCell2012;104(6):326-341

4 Seitz HM, Camenisch TD, Lemke G,etal. Macrophages and dendritic cells use different Axl/Mertk/Tyro3 receptors in clearance of apoptotic cells.JImmunol2007;178(9):5635-5642

5 Strick DJ, Feng W, Vollrath D. Mertk drives myosin Ⅱ redistribution during retinal pigment epithelial phagocytosis.InvestOphthalmolVisSci2009;50(5):2427-2435

6 Graham DK, Dawson TL, Mullaney DL,etal. Cloning and mRNA expression analysis of a novel human protooncogene, c-mer.CellGrowthDiffer1994;5(6):647-657

7 Kopec AM, Carew TJ. Growth factor signaling and memory formation: temporal and spatial integration of a molecular network.LearnMem2013;20(10):531-539

8 Nguyen DH, Catling AD, Webb DJ,etal. Myosin light chain kinase functions downstream of Ras/ERK to promote migration of Urokinase-type plasminogen activator-stimulated cells in an integrin-selective manner.JCellBiol1999;146(1):149-164

9 Hu WY, Han YJ, Gu LZ,etal.Involvement of Ras-regulated myosin light chain phosphorylation in the captopril effects in spontaneously hypertensive rats.AmJHypertens2007;20(1):53-61

10 Papermaster DS, Dreyer WJ. Rhodopsin content in the outer segment membranes of bovine and frog retinal rods.Biochemistry1974；13(11):2438-2439

11孫昱昭，洪晶.雙重熒光標記法檢測人視網膜色素上皮細胞吞噬的功能.國際眼科雜志2006;6(1)：42-46

12 Yue J, Mulder KM.Requirement of Ras/MAPK pathway activation by transforming growth factor beta for transforming growth factor beta 1 production in a Smad-dependent pathway.JBiolChem2000; 275(40):30765-30773

13 McCubrey JA, Steelman LS, Abrams SL,etal. Roles of the RAF/MEK/ERK and PI3K/PTEN/AKT pathways in malignant transformation and drug resistance.AdvEnzymeRegul2006;46:249-279

14 Shelby SJ, Colwill K, Dhe-Paganon S,etal.MERTK interactions with SH2-domain proteins in the retinal pigment epithelium.PLoSOne2013;8(2):e53964

15 Sasaki T, Hiroki K, Yamashita Y. The role of epidermal growth factor receptor in cancer metastasis and microenvironment.BiomedResInt2013;2013:546318

Yu-Zhao Sun, Ruo-Shuang Zhang, Feng Gu

Foundation item:Science and Technology Planning Project of Shenyang (No. F13-316-1-11)

Department of Ophthalmology, the First Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China

Correspondence to:Yu-Zhao Sun. Department of Ophthalmology, the First Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China. sunyz91667@sina.com

Received：2015-10-16Accepted：2015-12-20

Abstract

?AIM:To investigate relation between the phagocytic fuction of retinal pigment epithelial (RPE) cells and the signal transduction pathway of MERTK-Ras-extracellular signal regulated kinase kinase(MEK)-myosin light chain kinase(MLCK)-myosin.

?METHODS: Cultured 3～5 passage RPE cells of C57BL/6 mouse were incubated with rod outer segments (ROS) suspension (containing ROS 1×107/ml) at 37℃, then cells were rinsed at different times(30,60,120,180,240min) to terminate the phagocytosis. The kinetics of phagocytosis was measured by double-fluorescent labeling. The activity levels of MERTK, Ras, MEK and MLCK at different incubation times were measured by Western Blot with antibodies of MERTK, Ras and phospho-antibodies of MEK and MLCK, respectively. To repeat the measurement of the phagpcytic kinetics and activity levels of MERTK, Ras, MEK and MLCK at different incubation times after interference to Ras and Mertk gene in RPE cells by plasmid transfection.

?RESULTS: The phagocytic kinetics showed that the ingestion occurred at 30min of incubation. Ingested ROS by RPE cells increased until saturated at 180min. The protein levels of MERTK, Ras, MEK and MLCK in RPE cells increased during all the incubation periods compared with control group(P<0.05). After interference to Ras and MERTk gene in RPE cells by plasmid transfection, the protein levels of MERTK, Ras, MEK and MLCK and the quality of ingested ROS sustained at the lower levels during all the incubation periods, only a few ingested ROS were seen at 180 min. Compared with untransfected RPE cells, the protein levels of MERTK, Ras, MEK and MLCK and the quality of ingested ROS in siRas-RPE cells and siMERTK-RPE cells decreased distinctly at 120 min and 180 min during incubation(P<0.05).

?CONCLUSION: Ras-MEK-MLCK-myosin signal pathway is the downstream of MERTK receptor in the phagocytic process of RPE cells from mice.

KEYWORDS:?retinal pigment epithelium;phagocytosis; MERTK; Ras; myosin

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.1.07

收稿日期：2015-10-16 修回日期： 2015-12-20

通訊作者：孫昱昭.sunyz91667@sina.com

作者簡介：孫昱昭，畢業于中國醫科大學，眼科學博士，副教授，研究方向：視網膜變性基礎研究、眼表角膜病的基礎和臨床研究。

基金項目：沈陽市科技計劃項目(No.F13-316-1-11)
作者單位：(110001)中國遼寧省沈陽市，中國醫科大學附屬一院眼科