淺議種子真實性與品種純度鑒定方法的適用范圍與優劣

王靈敏，孟小莽，許豫南，孟宇辰

（1.石家莊市種子管理站，河北 石家莊 050051；2.東北林業大學國家生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

淺議種子真實性與品種純度鑒定方法的適用范圍與優劣

王靈敏1，孟小莽1，許豫南1，孟宇辰2

（1.石家莊市種子管理站，河北 石家莊 050051；2.東北林業大學國家生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

在鑒定品種純度時，根據不同品種采用不同方法進行真實性鑒定，對種子的鑒定工作可以起到事半功倍的效果。筆者總結了形態鑒定法、電泳法以及分子標記法等幾種鑒定種子純度的方法及適用范圍，并總結了各方法的優劣，供同行參考借鑒。

種子；純度鑒定

品種純度與真實性是農作物種子質量重要指標之一，品種純度的高低和種子的真假直接影響農作物的產量和品質。

品種純度與種子真實性鑒定的方法目前有形態鑒定法、生理生化法以及DNA分子標記法。不同作物、不同品種通過選擇適合的方法，可以做到簡單、經濟、快速又準確。

1 形態鑒定法

形態鑒定法包括種子形態鑒定法、種苗形態鑒定法和植株鑒定法幾種。

1.1 種子形態鑒定法

根據種子形狀、大小、顏色、質地及種子外表各部位的特征，鑒別本品種與異品種。如玉米種子可以根據粒型（馬齒型、半馬齒型、硬粒型）、粒色（白色、黃色、紅色、紫色），籽粒的頂部形狀（長方、長圓、圓），頂部顏色以及粉質的多少，胚的大小、形狀，胚部皺折的有無、多少，花絲遺跡的位置與明顯程度，稃色、籽粒棱角的有無及明顯程度等進行鑒定。

一些玉米雜交品種存在胚乳直感現象，可以用此法鑒別自交粒和雜交種。該法簡單、經濟、快速，但用于鑒定品種純度的特征有限，而且適用于形態性狀豐富且易觀察的作物品種，并且種子的大小、顏色易受成熟度、土壤和氣候的影響，且受主觀影響較大，故準確性較差，可酌情使用。

1.2 種苗形態鑒定法

根據不同品種幼苗的獨特性狀進行鑒定。如玉米芽鞘顏色分為紫色和綠色，用此性狀只適用于鑒別芽鞘顏色不同的玉米品種。該法簡便、省時，但僅適用于十字花科、豆科等幼苗形態性狀豐富的有限幾種作物，而且苗期所依據的性狀有限，受環境的影響頗大，測定結果不太準確。

1.3 植株形態鑒定法

即田間小區種植鑒定法。田間小區種植鑒定法是鑒定品種真實性和測定品種純度的最為可靠、準確的方法之一。

為了鑒定品種真實性，應在鑒定的各個階段與標準樣品進行比較，而且為使品種特征特性充分表現，在試驗設計和布局上要選擇氣候環境條件適宜、土壤均勻、肥力一致、前茬無同類作物和雜草的地塊，并有適宜的栽培管理措施。種植株數要根據種子質量標準而定，若標準為（N－1）×100%／N，種植株數應為4N。

通常根據品種審定公告中描述的特征特性，在苗期、花期、成熟期3個時期進行鑒定，尤其在特征特性表現最明顯時期必須逐株鑒定。如玉米種子必須在花期根據株型、株高、葉色、花絲花藥顏色、雄穗分枝等特征特性鑒定。

因依據的性狀較多，是以前最為通用且比較可靠的方法，但要求有適宜的光照、溫度等氣候環境條件，如玉米要采用冬季的海南種植鑒定，此法受地域的限制，或者采用當地的同期種植鑒定（當年所生產的種子要等下一個生長季節才能鑒定），需時較長，種子下地前不能鑒定種子優劣。

同時，要求檢驗員擁有豐富的經驗，熟悉被檢品種的特征特性，能正確鑒別植株是屬于本品種還是變異株，并能區分變異株是遺傳變異，而不是受環境影響所引起的變異。

另外，如果遭遇冰雹、大風、過熱過冷極端天氣及長期多陰雨天氣難以保證植株正常生長，就談不上鑒定準確。

目前一些作物骨干親本的集中頻繁使用，使育成品種間的遺傳差異越來越小，形態性狀檢驗越來越困難。電泳技術和DNA分子標記技術的應用，恰恰彌補了形態法的不足。

2 電泳法

電泳法中常用的技術有同工酶電泳技術和蛋白質電泳技術。

2.1 同工酶電泳法

利用電泳技術分離各種酶的同工酶，通過比較同工酶譜，鑒定種子純度。此法能分析大量樣品，較簡單、快速、可靠，不受環境影響。

但是，同工酶具有組織特異性、可利用的數量少、多態性少，對酶的提取要求高和電泳條件較為嚴格，還常因同工酶選擇不當、同工酶活性及表達易隨種子的貯藏和萌發過程發生變化等因素，影響鑒定結果的準確性，并且因酶易失活，難以大范圍推廣。

2.2 蛋白質電泳法

主要包括鹽溶蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳、醋酸尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳和超薄等電聚焦電泳。禾谷類根據種子醇溶蛋白的多樣性，形成電泳圖譜差異加以鑒別。該方法品種間譜帶差異較為明顯，互補帶清晰、分辨率高，提取和染色時間較短，簡單、經濟，穩定性、重復性好，在品種相對少的時期，為鑒定種子真實性和品種純度發揮了相對準確、較為快速的優勢，但對親緣關系較近的品種難以鑒別。

醋酸尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定玉米種子的純度，不需要用緩沖液配制分離膠和濃縮膠，簡化了操作步驟，并且其樣品提取和電泳時間都比較短，但是也有其局限性，如譜帶彎曲、界限不太清晰等。

超薄等電聚焦電泳技術采用水平平板電泳槽，凝膠超薄、雙聚焦，大大增加了點樣數量，操作方便、準確性高、制膠速度快，縮短了固定、染色和脫色時間，但是電泳所用的兩性電解質價格較貴。

同工酶電泳技術和蛋白質電泳技術具有快速、準確性高、重復性好的優點。但其畢竟是基因產物，勢必會受到各種環境因素的影響，而影響鑒定結果的準確性。

3 分子標記法

分子技術主要有RFLP技術、RAPD技術、AFLP技術、SSR技術以及新興的SNP技術。

3.1 RFLP技術

利用限制性內切酶切割不同品種的DNA時，產生DNA片段的數目和大小不同，通過電泳再進行Southern轉移到膜上，利用放射性同位素，用該探針與支持膜上的DNA雜交得到DNA的限制性片段，多態性加以區分。

RFLP標記大多數為共顯性，多態性穩定、特異性強、準確性高，但其過程繁瑣、周期長、操作難度較大，需要大量純度較高的DNA，耗費高，且放射性同位素的使用影響人體安全。這些缺點限制了其推廣應用。

3.2 RAPD技術

利用隨機引物對不同品種的基因組DNA進行PCR擴增、電泳，得到多態性DNA譜帶進行鑒定。此技術反應靈敏、多態性強、分辨率高、快速簡便、無放射性污染、DNA用量極少、成本較低，既有大量的隨機引物可供篩選之用，又不受種屬的限制。

但RAPD技術存在提供的信息不夠全、一般為顯性標記、不能區分雜合子與純合子、不同引物之間的擴增結果重復性和穩定性相差較大、引物篩選工作量大等不足，有一定的局限性。

3.3 AFLP技術

利用基因組DNA經酶切后形成大小不等的隨機限制性DNA片段，片段兩端連接上與酶切位點配對的特定接頭，用與接頭互補的專用引物進行PCR擴增、電泳、放射自顯影顯示DNA指紋。

AFLP是RFLP和PCR技術的結合，兼備RFLP的可靠性和PCR的高效性。但AFLP多態性檢出率過高，能檢出樣本內個體之間細微的差異，易形成假雜株，而且對DNA和內切酶的質量要求較高，實驗技能高和儀器設備精密，操作復雜，試驗周期長，加之是專利技術，不宜普及推廣。

3.4 SSR技術

根據SSR序列兩端保守的單拷貝序列，設計特異的引物，通過PCR擴增、電泳，得知不同個體在某個SSR座位上的多態性。

SSR標記完全符合作物品種鑒別的4個基本準則：環境的穩定性、品種間變異的可識別性、最小的品種內變異性和實驗結果的可靠性。

但是，對于品種間沒有位點差異的，誤判為兩個品種相同；不同平臺之間不能直接比較，整合需要設立參照樣品，甚至不同型號毛細管電泳儀之間的數據也需要進行位點的校準才能實現互通；毛細管電泳雖然可以實現多重，如果要增加通量和引物的數量，就會成倍增加工作量，大幅增加檢測成本。

3.5 SNP標記技術

SNP標記是在基因組上單個核苷酸的變異形成的遺傳標記。此法標記密度高，與功能基因的關聯度高，更容易開發到與性狀相關的SNP功能標記，遺傳穩定性強，檢測通量高，易實現自動化分析。SNP標記一般只有兩種等位基因型，數據統計簡單，且不依賴檢測平臺，容易實現不同來源數據的整合和標準化。

我國在農作物DNA鑒定指紋研究發展較快，特別是在主要農作物品種DNA分子檢測技術標準化和應用方面。在GB/T3543.5-1995《農作物種子檢驗規程真實性和品種純度鑒定》第1號修改單中，增加6.2.4條即DNA分子檢測方法：品種真實性驗證或身份鑒定，允許采用SSR和SNP分子標記方法。

截至2014年6月底，現行有效的農作物分子檢測標準有18項，涉及15類農作物。如NY/T 1432-2014、NY/T 2470-2013、NY/T 2595-2014、NY/T 2469-2013、NY/T 1433-2014，即玉米、小麥、大豆、陸地棉和水稻品種鑒定技術規程SSR標記法等。同時，新種子法第四十七條規定“：農業、林業主管部門可以采用國家規定的快速檢測方法對生產經營的種子品種進行檢測，檢測結果可以作為行政處罰依據”，這為種子質量監督及時到位提供了法律依據，也更加速了SSR標記法的推廣應用，在種子質量管理上發揮越來越重要的作用，為打擊假冒偽劣種子，保護育種者、種子生產經營企業和農民的合法權益提供重要的技術保障。

1005-2690（2016）08-0033-02

：S339.36+1

：A

2016-07-21）

王靈敏(1986-），女，河北石家莊人，本科，高級農藝師，從事種子質量監督與種子管理工作。