基于LC-MS技術修飾核苷作為腫瘤標志物的研究進展

張劍英，徐笑紅

(浙江省腫瘤醫院 檢驗科，浙江 杭州 310022)

基于LC-MS技術修飾核苷作為腫瘤標志物的研究進展

張劍英Δ，徐笑紅

(浙江省腫瘤醫院 檢驗科，浙江 杭州 310022)

修飾核苷是RNA的代謝產物，目前認為是一種廣譜的潛在腫瘤標志物(tumor marker，TM)，在腫瘤患者尿液中排放量較正常人顯著升高。液相色譜-質譜聯用(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)技術結合了色譜的高分離能力和質譜的高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對分子質量與結構信息的優點，已逐漸成為修飾核苷分析的的主要技術平臺之一。本文綜述了近年來LC-MS 技術在尿液修飾核苷分析方面的現狀與進展，并對其發展前景進行展望。

修飾核苷；腫瘤標志物；液相色譜-質譜聯用； 綜述

腫瘤標志物(tumor marker，TM)對腫瘤的早期診斷、預后判斷、治療指導及復發和轉移的監測都有重要作用。 修飾核苷是RNA的代謝產物，屬于內源性小分子，利用修飾核苷作為各種惡性腫瘤的潛在標記物已成為近年來研究的熱點。液相色譜-質譜聯用(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)技術不需要對樣品進行衍生化預處理，經濟實用，適用于熱不穩定，不易揮發，不易衍生化的物質。質譜(mass spectrometry，MS)技術的多通道監測功能與液相色譜(liquid chromatography，LC)技術的卓越分離能力，使LC-MS技術對檢測樣品的濃度和純度要求都很低，甚至對痕量物質，也能通過優化MS掃描模式，給出可視化響應。因此，已經成為尿液修飾核苷的定性定量分析的主要技術平臺。本文就近年來LC-MS 技術在尿液修飾核苷分析方面的現狀與進展進行綜述。

1 修飾核苷的來源和代謝

修飾核苷是機體RNA的代謝產物，是在轉錄后由多種特定的甲基轉移酶和連接酶作用于多聚核苷分子而形成的。例如：堿基甲基化，堿基乙基化[1]，碳氫鍵重排，尿苷移位等。RNA包含大量的修飾核苷，在已經報道的100多種修飾核苷中，其化學修飾都需要特定的酶來完成的。修飾核苷是在正常核苷的基礎上進行甲基化或其它的修飾，修飾的位置可能在糖苷鍵、糖羥基、堿基或者是堿基和糖羥基都被修飾，RNA修飾的位置是固定的，位置不正確的修飾核苷阻礙了細胞功能的正常的發揮。修飾核苷的獨特性決定了真核細胞的修飾需要100多種功能各異的酶來完成，其作用與維系自身結構和調節功能有關[2]。

在人和動物體內，正常未被修飾的核苷可以在酶的作用下，被磷脂化后再利用形成新的RNA，或降解為尿酸和β-丙氨酸。修飾核苷結構十分穩定，受外界影響因素少，既不能被磷酸酯化再利用也不易代謝，在尿中其排量恒定。在各種RNA中，轉運核糖核酸(tRNA)的含量最多(79種)[3]，因此尿中修飾核苷反映了有機體中tRNA的降解速率，進而提示體內細胞增殖情況。修飾核苷在正常成年人中排放恒定，幾乎不受性別、年齡、飲食的影響。而嬰兒和孕婦的排放水平較不穩定，其中嬰兒體內修飾核苷的排放量是成年人的6～10倍，可能與組織細胞的生長速度關系比較密切。此外，在一些疾病狀態下，例如炎癥性疾病、免疫性疾病，特別是泌尿系統感染時，尿液中修飾核苷的排放量會發生變化。

2 尿液修飾核苷作為腫瘤標志物的研究

TM根據其生化屬性及生理功能大體上可分為蛋白類標記物、基因類腫瘤標記物和內源性小分子類腫瘤標志物。內源性小分子是一種新型腫瘤標志物，它們與機體代謝密不可分。RNA修飾核苷屬于內源性小分子，尿中修飾核苷的排放水平可以反應機體細胞RNA的代謝速度以及細胞的增值情況。正常成年人由于細胞增殖處于相對穩定狀態，每天隨尿液排出的修飾核苷量也相對穩定；腫瘤細胞的增值比正常細胞快,導致修飾核苷的產生和排出增多。惡性增殖是腫瘤細胞的共同特點，當機體細胞發生癌變時，可以通過檢測尿中修飾核苷的含量，推測體內是否存在腫瘤，而不受腫瘤的病理類型及分化程度的影響。腫瘤患者尿液RNA修飾核昔含量高于正常人，原因主要有2個方面：①惡性腫瘤的大量細胞處于旺盛生長狀態，核酸代謝及蛋白合成速度加快，RNA代謝加快，修飾核苷產生增多；②有研究認為惡性腫瘤細胞中存在高活性的tRNA修飾酶[4]，可對正常結構的tRNA進行高度修飾產生異常tRNA，后者代謝過程中即可產生大量修飾核苷。

近年來的研究結果表明修飾核苷是一類非常有潛力的TM，在多種常見類型腫瘤患者尿液中排放水平較正常人顯著升高[5-7]。尿液修飾核苷具有其他TM所不具備的特征：①具有穩固的分子結構，不容易發生反應和改變形態；②尿液樣本方便易得，具有無創性，可連續取樣，便于跟蹤監測；③可識別的腫瘤譜系廣；④除了嬰兒和孕婦外，修飾核苷在正常成年人中排放恒定，幾乎不受性別、年齡、飲食的影響[8]。作為腫瘤篩查和診斷的手段，尿液修飾核苷可與蛋白類和基因類TM互補，補充這兩種標記物腫瘤譜窄、腫瘤敏感性不高的不足，其臨床應用前景廣闊。

3 LC-MS在尿液核苷檢測的應用

目前，尿液修飾核苷的分析手段主要有免疫分析法、氣相色譜(gas chromatography，GC)法、高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法、高效毛細管電泳(high-performance capillary electrophoresis，HPCE)法、和LC-MS等。免疫分析法尿中核苷組分和其他成分會發生交叉反應，減少了定量分析的準確度，且該技術無法一次實現大量核苷組分的測定；GC法由于受揮發性的限制,雖然經過了化學衍生,也無法檢測到一些高度修飾的核苷；HPLC 法和HPCE法的定量檢測重現性較差。LC-MS技術不僅具有很高的靈敏度,而且具有廣泛的適應性、選擇性和高通量的特點，可以對大量的修飾核苷進行定性和定量,已逐漸成為修飾核苷分析的的主要技術平臺之一。

3.1 樣品采集和預處理 尿液標本由于采集容易,對患者無創傷性,也不會產生應激反應，實驗中得到的數據比較可靠。首先需要采集足夠數量的樣本，從而有效減少源于尿液樣本個體差異對分析結果的影響，得到有統計學意義的分析數據。早期研究尿中修飾核苷需要收集24h尿液，現有的研究表明用“隨機尿樣”檢測，以核苷含量(nmol)/肌酐(μmol)作為標準可取得與24h尿樣一樣的結果，大大方便了核苷的檢測。當分析的化合物在紫外線下不穩定時，需要在尿液中加入抗氧化劑。此外，需要長期保持的標本還需加入防腐劑。Rodriguez-Gonzalo等發現修飾核苷在長期的凍融循環條件下仍能保持穩定性[9]。由于尿中多達上萬種化學物質, 核苷的含量很低,其他成分的干擾太多,無法直接對樣品進行分析，需要對樣本進行預處理。除了簡單的離心除去沉淀，最常用固相萃取(solid phase extraction，SPE)技術除去蛋白和鹽類。SPE技術具有污染小、回收率高、溶劑量小的優點，目前已廣泛用于尿液核苷的分析。

在影響SPE效率的因素中，吸附劑的選擇是至關重要的影響因素。早期最常用PBA作為吸附劑來分離提取尿中核苷成分[10]，該材料為一種硅膠型吸附劑，含有苯硼酸官能團, 對順式二醇類化合物具有高的選擇性和分離富集功能,最大的缺點是對尿液中其他結構核苷的提取有很大局限性。陽離子交換固相萃取能彌補這一缺陷，吸附劑含有硫酸官能團，能萃取所有酸性含氮核苷。有研究發現，與PBA萃取小柱比較，利用 Oasis HLB(二乙烯基苯-N-乙烯基吡咯烷酮共聚物)萃取小柱能獲得更多種類的核苷，該類型吸附劑為適合于酸性，中性和堿性化合物的通用型吸附劑，已成為核苷提取的最重要的萃取吸附劑之一。除了上述離線萃取技術，在線樣品萃取技術結合高效液相色譜聯用的方法結合了二者的優勢, 目前在修飾核苷的分析中得到了廣泛的應用。Rodriguez-Gonzalo等利用N-乙烯基乙酰胺共聚物萃取小柱在線萃取，ZIC-HILIC 親水色譜串聯質譜的方法檢測了核苷和脫氧核苷[9]。Tuytten等[11]同樣利用硼酸親和柱在線萃取、HILIC 親水色譜串聯質譜的方法檢測了修飾核苷。在線SPE技術將萃取凈化和HPLC 和MS 分析結合用于樣品的直接分析，可以提高方法的重現性和靈敏度,減少人為干預, 分析數據的質量也會顯著提高。

3.2 基于LC-MS的數據采集 LC-MS 聯用技術由液相色譜、接口裝置、質譜3大系統組成。要想實現LC 和MS 的聯用，接口裝置是關鍵。LC-MS離子源主要起到使化合物離子化的作用并作為液相和質譜聯用的接口，主要有大氣壓離子源(atmospheric pressure ionization，API)、快原子轟擊源(fast atomic bombardment，FAB)和基質輔助激光解析電離源(matrix assisted laser ionization source，MALDI)3種電離方式。其中API包括電噴霧電離(electrospray ionization，ESI)、大氣壓化學電離(atmospheric pressure chemical ionization，APCI)和大氣壓光電離(atmospheric-pressure Photoionization，APPI)3種離子源，這3種模式的樣品離子化都可以在大氣壓下的離子化室內完成，離子化效率高，大大增強了分析的靈敏度和穩定性[12]。在目前報道的尿液核苷的相關研究中，主要有FAB、MALDI和ESI 3種離子源，均為軟電離方式。其中ESI適用于從中等極性化合物到高極性化合物的大分子物質,是目前報道的核苷定量分析利用最多的離子化方式,可以很方便地與其他分離技術聯接，如液相色譜、毛細管電泳等，可方便地純化樣品用于質譜分析。其主要優點是：離子化效率高；離子化模式多，正負離子模式均可以分析；可與大流量的液相聯機使用；通過調節離子源電壓可以控制離子的斷裂，給出結構信息。在修飾核苷的分析過程中，大多數報道都利用ESI正離子模式, ESI源的正離子模式產生的離子信號強度遠遠強于負離子模式[13]。

質量分析器是質譜儀中最核心最重要的部分，按采集離子的原理可分為連續檢測離子的質譜儀和脈沖式質譜儀。所謂的連續檢測離子的質譜儀則主要是通過掃描的方法去檢測連續生成的離子主要包括三重四級桿質譜(triple quadrupole mass spectrometry，QqQ-MS)、磁質譜等；脈沖式質譜儀即是一類需要利用脈沖或門控形成離子,或者是采用離子注入等方式來檢測離子主要包括飛行時間質譜(time of flight mass spectrometry，TOF-MS)、傅里葉變換回旋共振質譜(fourier transform cyclotron resonance mass spectrometry，FTICR-MS)、離子阱質譜(ion trap mass spectrometry，IT-MS)等。在修飾核苷的LC-MS分析中，常見的質量分析器是QqQ-MS、TOF-MS以及IT-MS。最初，離子源的類型與分析儀的類型必須是匹配的，比如MALDI離子源只能與TOF分析儀連接。隨著分析技術的不斷發展，各種類型的離子源可以與不同類型的分析儀連接。Bond等[1]利用3種不同的方法分析尿液中修飾核苷：氣相色譜質譜連用儀(GC/MS)、高效液相色譜離子阱質譜聯用儀(HPLC/IT-MS)和毛細管液相色譜三重四極桿質譜聯用儀(CAPLC/QqQ-MS)。經過比較發現, GC/MS的靈敏度比HPLC/ITMS要低1個數量級。HPLC/IT-MS和CAPLC/QqQ-MS適合檢測脫氧、甲基化、乙酰化的修飾核苷組分,而且檢測到的核普種類也更多, CAPLC/QqQ-MS在測定某些特定的修飾核苷和定量分析尿液核苷的差異表達時靈敏度高于HPLC/IT-MS。Zhao等[10]利用在線的PBA聯用HPLC/TOF-MS與UPLC/TOF- MS分別對核苷進行廓形分析，發現UPLC/TOF/MS分析儀的速度和色譜的準確度都優于HPLC/TOF/MS。

腫瘤患者體內腫瘤特異性的tRNA高度修飾, 尿液修飾核苷的種類千變萬化,尿液中修飾核苷的結構鑒定總是很困難，其中部分原因之一在于部分產物化學分子式相同而結構不同，比如尿嘧啶和它的異構體假尿嘧啶。隨著LC-MS聯用技術的不斷發展，至今已能準確對部分核苷進行鑒定。對有標樣的修飾核苷，可通過比較測定核苷與標樣核苷峰的保留時間、核苷的精確分子量以及MS/MS分析等進行鑒定；對沒有標樣的修飾核苷，可通過高分辨質譜、二級質譜的分析以及比較標樣核苷裂解的規律等進行鑒定。Bullinger等[14]利用LC/ESI-IT-MS分別在MS3及MS6中利用掃描監測模式推導出了核苷代謝物的裂解方式，有4個修飾核苷首次得到了鑒定，它們是2-methylthio-N6-threonyl-carbamoyladenosine,5-methoxycarbonylomethyl-2-thiouridine,2-methylthio-N6-(cis-hydroxyisopentenyl)-adenosine and N6-methyl-N6-threonylcarbamoylo-adenosine。 Kammerer等[15]利用MALDI-TOFMS定性出多種核苷，利用LC/IT-MS得到16種核苷的碎片信息，并以此推導裂解方式。李華雨等[16]利用HPLC-ESI-Q-TOFMS技術準確鑒定了9種有標樣和17種無標樣的修飾核苷。雖然各種聯用技術在使用過程中存在耗時的缺點，由于解決了修飾核苷的鑒定困難的難題，非常有利用價值。

4 LC-MS在修飾核苷作為TM的應用研究

早在l960年，Adams等[17]在研究白血病患者嘌呤和嘧啶分泌水平時發現白血病患者尿中Pseu和m22G水平較正常人增高，認為患者尿中的這兩項指標可以作為白血病的腫瘤標記物。此項研究激發了將修飾核苷作為TM的探索，修飾核苷作為具有潛力的TM近年來在代謝組學方面發展迅速，已發現對多種常見腫瘤的診斷、病情監測以及了解療效和預后起到積極作用[13]，基于LC-MS技術在修飾核苷研究方面的獨特優勢,已成為修飾核苷作為TM研究的主流技術。Hsu等[6]利用HPLC-ESI-Q-IT-MS技術發現, 乳腺癌患者尿液中胞苷、3-甲基胞苷和次黃苷的排放水平較正常人顯著升高，discriminative power分別為58%，58%，62%，認為上述3項核苷是乳腺癌的潛在TM，并建議聯合應用多項的修飾核苷標志物以提高乳腺癌的檢出率。Struck等[18 ]利用HPLC-ESI-QqQ-MS技術對泌尿生殖器腫瘤患者尿液中的12種修飾核苷進行定量分析，發現其中5種核苷(6-甲基腺苷、次黃嘌呤核苷、 2-甲基鳥苷、3-甲基尿苷和N2，N2-二甲基鳥苷)和健康人相比具有顯著性差異(P<0.05)。同樣，Daghir等[19]利用LC-MS/MS技術對12個修飾核苷進行了定量分析，認為2-甲基鳥苷和N2，N2-二甲基鳥苷可能是泌尿生殖器腫瘤的潛在TM。Hsu等[20]利用HPLC-MS/MS技術發現腺嘌呤核苷, 胞嘧啶核苷、 3-甲基嘧啶核苷、1-甲基腺苷、 次黃嘌呤核苷 和2-脫氧鳥嘌呤核苷是胃癌和結腸癌診斷的有用標志物，聯合檢測有助于提高腫瘤的診斷率。Zhang等[21]利用HPLC/ESI-Q-TOF-MS技術在膀胱癌患者尿液中發現1-甲基腺苷和1-甲基次黃嘌呤核苷聯合檢測時敏感性和特異性分別為92.45%和87.50%。患者術后尿液中2種核苷排放量較術前均顯著降低(P<0.01)；同時術后1年復發患者尿液中2種核苷排放量較未復發者顯著升高(P<0.01)，認為1-甲基腺苷和1-甲基次黃嘌呤核苷可能是膀胱癌潛在的重要TM，在膀胱癌的診斷、治療以及預后過程中都具有一定意義。在結、直腸癌也有報道2種修飾核苷濃度與腫瘤患者預后相關。Seidel[5]等研究發現尿液修飾核苷可作為肺癌高危人群的篩查分子標志物。另有學者報道部分尿液修飾核苷的排放水平可作為預測肺癌患者生存期的指標。

5 展望

隨著LC-MS技術的發展，無論在核苷代謝產物的定性方面，還是差異代謝物的定量分析方面，LC-MS都有著顯著的優勢和鮮明的特點，但其本身仍然具有很大的發展空間，且面臨著挑戰。首先，LC-MS技術雖然檢測靈敏度較高，但對痕量物質的鑒定和精確定量,仍還存在不少困難；生物樣本間的個體差異導致了不同的基質效應，如何在復雜生物基質條件下對核苷代謝物進行準確的定量分析也是面臨的挑戰之一；此外，目前LC-MS技術可供搜索用于確定化合物結構的數據庫尚有限，不能滿足所有復雜多樣核苷代謝物研究大的需要。未來將會有更多的新技術、新方法出現，相信LC-MS技術在修飾核苷作為TM的研究領域會不斷深入。

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(編校：王冬梅)

Research progress of urinary modified nucleosides as tumor markers by LC/MSZ

HANG Jian-yingΔ, XU Xiao-hong

(Department of Clinical Laboratory, Zhejiang Cancer Hospital, Hangzhou 310022, China)

Modified nucleosides are the RNA metabolites,and are well known as potential marker in various types of cancer. They are mainly detected in urine wherein thier concertrations were found elevated in cancer patients. Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS) technique has been widely used in the field of modified nucleosides analysis, which can not only reach the point of high separating capacity of chromatography but also be provided with high selectivity, sensitivity, and relative molecular mass and structure information of mass spectrum.This review deals with the current status and future trends in the analysis of urinary modified nucleosides as tumor markers by LC-MS technique.

modified nucleosides; tumor marker; liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS); review

浙江省醫藥衛生科技計劃(2016KYA034)

張劍英，通信作者，女，碩士，主管技師，研究方向：腫瘤免疫，E-mail:951094@163.com。

R979.1

A

1005-1678(2016)02-0182-04