關于B 7-H 5/CD 28 H信號途徑在結直腸癌中的表達以及對抗腫瘤免疫的影響分析

劉海霞蔣業坤蔣漢茂曾之耀甘小艷徐軍發

關于B 7-H 5/CD 28 H信號途徑在結直腸癌中的表達以及對抗腫瘤免疫的影響分析

劉海霞1蔣業坤1蔣漢茂1曾之耀1甘小艷1徐軍發2

【摘要】目的 通過檢測B 7-H 5在不同分期的結直腸癌組織中的表達差異，研究B 7-H 5與腫瘤分期的關系，并通過比較腫瘤浸潤細胞對不同表達程度的腫瘤細胞的殺傷試驗，探索B 7-H 5在抗腫瘤免疫中的作用。方法 納入健康志愿者、T1～T4期結直腸癌患者各20例，比較其外周血及組織中B 7-H 5的表達情況；提取組織中的腫瘤浸潤細胞，在體外進行擴增，檢測其對不同B 7-H 5表達水平腫瘤細胞的殺傷活性。結果 健康人外周血中無B 7-H 5，腫瘤分級越高，血液及組織中B 7-H 5的表達越高，提示B 7-H 5可以作為腫瘤嚴重程度的潛在指標。腫瘤浸潤細胞殺傷試驗表明，B 7-H 5是腫瘤殺傷的抑制因素。結論 血液及組織中B 7–H 5的表達含量可作為腫瘤分期及腫瘤免疫治療療效預測的潛在指標，但因本試驗樣本量較小，仍需要進一步的驗證。

【關鍵字】結直腸癌；B 7-H 5；腫瘤浸潤細胞

B 7-H 5，又名VISTA、Gi 24或Dies1，是最新鑒定的B 7共刺激分子家族的成員[1]。研究表明[2]，B 7-H 5在成熟的髓系抗原提呈細胞中高表達，而在活化的調節性T細胞中低表達。B 7-H 5主要通過CD-28 H受體信號途徑進行信號轉導，在適應性免疫中發揮著重要的作用。本項目組前期研究結果顯示B 7-H 5 mRNA在結直腸癌組織中的表達低于正常人結直腸組織。本項目擬檢測B 7-H 5在不同健康志愿者中，分析結直腸癌組織中的表達，其表達量與分期的關系。同時對組織中的腫瘤浸潤細胞進行體外分離擴增，細胞腫瘤殺傷試驗，探索B 7-H 5信號通路對抗腫瘤免疫的影響。

1　資料與方法

1.1 B 7-H 5在結健康人及結直腸癌組織中的表達

1.1.1 實驗分組 本次實驗分為健康志愿者組及結直腸癌患者組。健康志愿者入選標準：（1）年齡40～65歲，男女各半。（2）未患有腫瘤，血、尿、便常規檢查正常。（3）志愿簽署知情同意書。結直腸癌患者入選標準：（1）年齡40～65歲，男女各半。（2）經病理檢查確診為結腸癌或直腸癌。（3）腫瘤TNM病理分期為T1～T4期，每期各20例，男女各半。最終共入組健康志愿者20例，平均年齡（55.2±12.1）歲，男性10例，女性10例；結直腸癌患者組根據TNM分期進行分組，T1、T2、T3、T4期患者各納入20例，T1組平均年齡（54.1±12.4）歲，T2組平均年齡（57.1±12.9）歲，T3組平均年齡（51.6±13.4）歲，T4組年齡（59.3±14.1）歲，每組男性10例，女性10例。

1.1.2 樣本收集 （1）血液樣本：健康志愿者于早晨空腹抽取靜脈血10 ml，肝素抗凝；結直腸癌患者于手術前和手術后一周空腹抽靜脈血10 ml，肝素抗凝，分離血漿放-80℃冰箱中保存，血細胞分離單個核細胞份兩份，一份置1 ml Trizol試劑中并于-80℃冰箱中保存，另一份細胞保存液中置液氮中保存。（2）組織樣本：手術中收集腫瘤患者正常腸組織、腸癌組織和癌旁組織，將組織塊分成4份，其中一份放液氮中保存、一塊置福爾馬林中保存、一份放1 ml Trizol試劑中并于-80℃冰箱中保存，第4份提取單個核細胞。

1.1.3 指標檢測 （1）采用酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測健康志愿者及患者的外周血標本中B 7-H 5的含量。（2）采用免疫組化法對組織樣本進行檢測，檢測結直腸正常組織、結直腸癌組織中B 7-H 5的表達情況，組化結果分為4級，1級為陰性，2級為1%～30%的細胞染色，3級為31%～60%的細胞染色，4級為超過60%的細胞染色。

1.2 B 7-H 5/CD 28 H信號途徑對抗腫瘤免疫的影響

1.2.1 腫瘤細胞及腫瘤浸潤細胞的制備 （1）B 7-H 5（+）腫瘤細胞：直接分離B 7-H 5（+）的腫瘤細胞。（2）B 7-H 5（-）腫瘤細胞：采用B 7-H 5 shRNA慢病毒載體感染腫瘤細胞，沉默腫瘤細胞B 7-H 5的表達。（3）B 7-H 5（++）過表達腫瘤細胞：采用B 7-H 5慢病毒表達載體感染腫瘤細胞，作為B 7-H 5過表達組。（4）腫瘤浸潤細胞TILs：從癌組織中直接分離TILs，在體外用高劑量IL-2體外培養達到擴增的目的。

1.2.2 體外抗腫瘤效應試驗 采用LDH釋放法檢測TILs對上述制備的腫瘤細胞進行殺傷試驗，檢測TILs的抗腫瘤效應，進行殺傷試驗的分組。見表1。

表1　 LDH釋放法腫瘤殺傷試驗分組

表2 術前血液中B 7-H 5含量與腫瘤分期的關系

表3　 術后血液中B 7-H 5含量與腫瘤分期的關系

1.3 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件進行統計分析，對于連續型變量指標，如果滿足正態分布且組間方差齊性檢驗合格則采用方差分析進行比較，如不滿足則采用Wilcoxon秩和檢驗進行比較；對于率的指標采用χ2檢驗進行比較，P＜0.05，差異具有統計學意義。

2　結果

試驗結果表明，手術前及手術后，健康志愿者血液中的可溶性B 7-H 5含量與及各級腫瘤患者均無統計學差異。見表3、表4。

3　討論

近年來，腫瘤的發病率逐漸增高，尤其是惡性腫瘤，已成為危害人類健康的主要疾病之一[3]。細胞免疫在抗腫瘤免疫中起決定性作用，研究發現[4]腫瘤患者細胞免疫功能低下，可能是腫瘤免疫逃逸的重要原因。探討腫瘤逃逸、機體抗腫瘤細胞免疫作用的機制不僅對闡明腫瘤免疫的基本原理具有重要意義，也將為腫瘤免疫治療提供理論依據。機體腫瘤免疫主要是由T細胞介導的細胞免疫，其通過對腫瘤特異性抗原進行識別，活化T細胞，產生腫瘤特異性效應T細胞[5]，進而發揮其特異性的免疫殺傷作用。初始T細胞活化的雙信號學說已獲公認，該學說認為初始T細胞活化需要兩個信號共同參與，即T細胞受體（TCR）與抗原肽-MHC復合物特異性結合的第一信號，APCs表面的B 7家族或其它共信號分子與其受體結合的第二信號。當第二信號缺乏時，T細胞識別抗原后將不能有效增殖，導致免疫無應答，使腫瘤細胞發生免疫逃逸。

綜上所述，B 7-H 5分子的表達與結直腸癌腫瘤惡性程度具有一定的相關性，這使得B 7-H 5有可能作為結直腸癌惡性程度及預后的預測指標之一。

參考文獻

[1] Ceeraz S, Nowak EC, Noelle RJ. B7 family checkpoint regulators in immune regulation and disease[J]. Trends in immunology，2013，34 （11）：5565-5563.

[2] 張蕾，李芳秋，張士新，等. LDH釋放法檢測腫瘤患者PBMC 和CIK細胞的細胞毒活性[J]. 現代檢驗醫學雜志，2008，23（6）：27-29.

[3] Dong H, Chen L. B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity [J]. J Mol Med （Berl），2003，81（5）：281-287.

[4] Kryczek I, Wei S, Zhu G, et al. Relationship between B7-H4, regulatory T cells, and patient outcome in human ovarian carcinoma[J]. Cancer research，2007，67（18）：8900-8905.

[5] Zhu Y, Yao S, Iliopoulou BP, et al. B7-H5 costimulates human T cells via CD28H[J]. Nat Commun，2013（4）：2043.

作者單位：1 425000湖南省永州市中心醫院；2 523808東莞，廣東醫學院

Analysis Effect of B 7-H 5/CD 28 H Signal Pathway Expression in Colorectal Cancer and Antitumor Immune

LIU Haixia1JIANG Yekun1JIANG Hanmao1ZENG Zhiyao1GAN Xiaoyan1XU Junfa21 Yongzhou Central Hospital in Hu’nan Province, Yongzhou 425000, China. 2 Guangdong Medical College, Dongguan 523808, China

[Abstract]Objective Through the detection of B 7-H 5 expression differences in different stages of colorectal cancer tissue, study the B 7-H 5 and the relationship between the tumor stage, and by compare the tumor infiltrating cells destruction test on different expression level of tumor cells, explore the B 7–H 5 role in antitumor immunity. Methods In healthy volunteers, T 1-T 4 and 20 patients with colorectal cancer, compare the B 7–H 5 expression in peripheral blood and tissue, Extract the tumor infiltration in the tissue cells, in vitro amplification, detection of the expression level of different B 7–H 5 tumor cell killing activity. Results Healthy people without B 7–H 5 in peripheral blood, the higher the tumor grade, blood and tissue in the higher expression of B 7–H 5, prompt B 7–H 5 can be used as potential index of the extent of tumor. Tumor infiltrating cells selectively. the test showed that B 7–H 5 was tumor inhibitory factors. Conclusion The expression of B 7–H 5 content in blood and tissue can be use as a tumor stage and tumor immunotherapy effect forecast potential index, but because of the test sample size is lesser, still needs further validation.

[Key words]Colorectal cancer, B 7–H 5, Tumor infiltrating cells

基金項目：湖南省衛生廳科研基金課題申請書（課題號：B2014-179）課題名稱（B7-H5/CD28H信號途徑在結直腸癌中的表達及其對抗腫瘤免疫的影響）

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.23.032

【文章編號】1674-9308（2015）23-0046-02

【文獻標識碼】B

【中圖分類號】R735.3+7