非諾貝特與吡格列酮對佐劑性關節炎大鼠抗炎作用研究

陳虹

非諾貝特與吡格列酮對佐劑性關節炎大鼠抗炎作用研究

陳虹

【摘要】目的探討非諾貝特與吡格列酮對佐劑性關節炎大鼠的抗炎效果。方法24只雄性Lewis大鼠隨機分成4組，空白組、模型對照組:給予等量的羧甲基纖維素;非諾貝特組: 100mg·kg－1·d－1、吡格列酮組: 30mg·kg－1·d－1，于造模后開始給藥，共給藥21 d。大鼠尾靜脈皮內注射完全弗氏佐劑每只0.1ml，制備AA大鼠模型。關節炎的嚴重程度是由臨床觀察(體重，關節炎指數評分，足跟腫脹度)進行評估。骨密度(BMD)，骨礦物質含量(BMC)于給藥20 d由雙能X線骨密度儀測定。應用real-time PCR法檢測IL-1β，IL-6和IL-10mRNA的表達水平。結果與模型對照組相比，非諾貝特組和吡格列酮組關節炎指數評分和足跟腫脹度明顯降低(P＜0.05)，骨密度和骨礦物質含量明顯增加(P＜0.05)，IL-1β和IL-6mRNA的表達水平明顯增加(P＜0.05)，IL-10mRNA的表達水平降低(P＜0.05)。結論非諾貝特和吡格列酮對大鼠佐劑性關節炎具有一定的治療作用。

【關鍵詞】佐劑性關節炎;非諾貝特;吡格列酮;骨

【中圖分類號】R 966

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002－7386(2015)16－2422－04

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.16.006

【Abstract】Objective To investigate the anti-inflammatory effect of fenofibrate and pioglitazone on adjuvant arthritis(AA)in rats.Methods Twenty-fourmale Lewis rats were randomly divided into four groups.The rats in blank group andmodel group were treated orally with same doses of carboxymethylcellulose for 21 days，however，the rats in fenofibrate group or pioglitazone group were treated orally with fenofibrate 100mg－1·kg－1day－1or pioglitazone 30mg－1·kg－1·day－1for 21 days，respectively.The ratmodels with AA were established by caudal vein intradermal injection with complete Freund’s adjuvant 1mg/each rat.The severity of AA was evaluated by observing clinical indexes including body weight，AA index score，swelling degree of heel.Bonemineral density(BMD)and femoral bonemineral content(BMC)weremeasured by dual-energy X-ray absorptiometry at day 20.The expression levels of IL-1β，IL-6 and IL-10mRNA were detected by Real-time RT-PCR.Results As compared with those inmodel group，the AA index score and swelling degree of heel were significantly decreased in fenofibrate group(100mg－1·kg－1·d－1)and pioglitazone group(30mg－1·kg－1·d－1)(P＜0.05)，however，BMD and BMC were significantly increased，so were the expression levels of IL-1β，IL-6mRNA(P＜0.05)，but the expression levels of IL-10mRNA were obviously decreased(P＜0.05).Conclusion Both pioglitazone and fenofibrate have certain therapeutic effects on experimental adjuvant arthritis in rats.

收稿日期:(2015－02－03)

作者單位: 300162天津市，武警后勤學院附屬醫院藥材科

The anti-inflammatory effect of fenofibrate and pioglitazone on adjuvant arthritis in rats

CHEN Hong.Department of Pharmacy，Affiliated Hospital of Tianjin Armed Police Logistics College，Tianjin 300162，China

【Key words】adjuvant arthritis; fenofibrate; pioglitazone; bone

基因轉錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator activated receptor，PPAR)屬核激素受體超家族，是一種細胞核內受體，由激活劑活化后可調控多種核內靶基因的表達，影響人體糖脂代謝、細胞發育等過程［1］。PPARs共有PPARα、PPARγ、PPARδ三種亞型。PPAR-α和PPAR-γ是PPARs家族的主要成員，參與脂質代謝、炎癥、能量動態平衡和胰島素敏感性調節等許多生物學過程，它們的相關作用可能與脂肪因子和脂肪細胞來源的信號分子有關［2］。非諾貝特(Fenofibrate)是PPARα激動劑，目前臨床上用于降血脂的藥物［3］。吡格列酮(Pioglitazone)是PPARγ激動劑，作為一種新型胰島素增敏劑，與胰島素抵抗和糖脂類代謝密切相關，主要用于降低II型糖尿病患者血糖［4］。類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種不明病因的慢性和系統性自身免疫性疾病。RA以慢性疼痛和多關節的腫脹為主要臨床表現，主要導致滑膜增生，骨質破壞和軟骨退化等病理特征［5］。本研究中，比較PPAR-α激動劑(非諾貝特)和PPAR-γ激動劑(吡格列酮)對關節炎發展和炎性因子的影響。

1　材料與方法

1.1動物與試劑Lewis大鼠24只，雄性，清潔級，體重150～175 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，適應喂養7 d用于實驗。非諾貝特(每片100mg):徐州恩華制藥廠;吡格列酮(每片15mg):北京太洋藥業有限公司;完全弗氏佐劑(Freund’s adju-

vant)，Sigma公司產品;

1.2實驗分組24只大鼠隨機分為4組，每組6只:空白組、模型對照組、非諾貝特組:100mg·kg－1·d－1、吡格列酮組:30mg·kg－1·d－1。非諾貝特和吡格列酮均溶于水后口服給藥，根據體重按1ml/100 g給藥，空白對照組和模型組給予等量的羧甲基纖維素。

1.3佐劑性關節炎(AA)大鼠模型的建立及給藥除空白組外，另3組18只大鼠，將大鼠右后跖皮內注射弗氏完全佐劑0.1ml致炎，制成AA模型，致炎當天記為0 d。治療組從0～21 d持續給藥。

1.4檢測指標

1.4.1體重:所有大鼠每4天測量1次體重，從第0 ～21天。

1.4.2關節炎指數評分:造模后12 d，每隔3～4 d對4組大鼠進行關節炎指數評分: 0分:關節無紅腫; 1 分:小趾關節稍腫;2分:合足趾和趾關節腫脹;3分:踝關節以下足爪腫脹; 4分:包括踝關節全部足爪腫脹。把各個關節的積分累計起來，即為每只大鼠的關節炎指數評分，每只大鼠分數最高16分。

1.4.3足跟腫脹度的測定:分別于造模第0、5、9、13、17、20天使用足跖容積測量儀測量大鼠對側腳踝關節及足跖部腫脹，詳細記錄計算腫脹度(ml)。

1.5骨密度測量采用GE Lunar Prodigy型雙能X線骨密度儀分別于20 d檢測大鼠整體及左股骨為興趣區(ROI)的骨密度值(Bonemineral density，BMD)(g/cm2)和0～20 d檢測整體骨礦物質含量(Bonemineral content，BMC，g/cm)，每組數據重復測量3次取平均值。

1.6 RT-PCR檢測細胞因子mRNA的表達情況末次給藥后2 h，無菌分離滑膜組織，液氮中保存備用。以TRIZOL提取組織中的總RNA，取1 μg總RNA配置逆轉錄反映體系，逆轉錄合成cDNA，并以此為模板利用PCR方法進行擴增。其中在PCR反應中所使用的引物分別為: IL-1β:正義鏈，5’-CAAGTCTCCCACCAGCTCTGTA-3’，反義鏈，5’-GGGCTTCTTCAGCTTCTCCAA-3’; IL-6:正義鏈，5’-TTAAGTACATCCTCGGCAAAATCT-3’，反義鏈: 5’-CAGTGCCTCTTTGCTGTCTTCA’; IL-10:正義鏈，5’-CGGGAGGGTGAAGACTTTCT-3’，反義鏈，5’-GGCATCACCTCCTCCAAGTA-3’［6］。檢測按照實驗室常規方法進行PCR擴增。定量PCR采用的體系為: dNTPs 2 μl，10×buffer 5 μl，上下游引物各10 pmol，Pfu酶0.5 μl，模板2 μl，加三蒸水至總體積50 μl;擴增條件為:預變性94℃5min，進入循環，變性94℃1min，退火60℃ 1min，延伸72℃3min，30個循環后，72℃延伸5min。以β-actin為內參，依據2-ΔΔCT法計算各組細胞mRNA的相對表達量。

1.7統計學分析應用SPSS 16.0統計軟件，計數資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1非諾貝特和吡格列酮對大鼠關節損傷程度的影響4組大鼠體重均有所增加，AA大鼠體重8 d達到高峰，之后隨之下降，模型對照組和吡格列酮組體重變化相似，非諾貝特組AA大鼠接受藥物治療12 d后，體重較模型對照組明顯增加(P＜0.05)。見圖1，表1。

圖1　4組大鼠體重

表1　4組大鼠體重　g

非諾貝特和吡格列酮用藥12 d后與模型對照組比較關節炎指數評分明顯降低，用藥12 d，16 d，20 d差異有統計學意義(P＜0.05)。非諾貝特組優于吡格列酮組。見圖2，表2。

圖2　4組大鼠關節炎指數評分重

表2　4組大鼠關節炎指數評分

非諾貝特和吡格列酮用藥1～8 d時與同期空白

組和模型對照組相比，足腫脹無明顯變化，甚至有個別加重趨勢。待用藥后8 d后，非諾貝特和吡格列酮用藥AA大鼠關節腫脹度較模型組有降低趨勢，用藥12 d，16 d，20 d差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖3，表3。

圖3　4組大鼠腫脹度

表3　4組大鼠腫脹度　ml

2.2非諾貝特和吡格列酮對AA大鼠BMD和BMC的影響采用雙能X線骨密度儀檢測BMD和BMC的改變，非諾貝特組AA大鼠接受藥物治療20 d后，全身及ROI區骨密度較模型對照組明顯改善(P＜0.05)，吡格列酮組與模型對照組無顯著性差別。AA大鼠ROI區骨礦物質含量(BMC)明顯降低，非諾貝特和吡格列酮治療后，AA大鼠BMC含量明顯增加(P ＜0.05)。見圖4、5，表4、5。

圖4　非諾貝特和吡格列酮對AA大鼠BMD的影響

表4　非諾貝特和吡格列酮對AA大鼠BMD的影響

圖5　非諾貝特和吡格列酮對AA大鼠BMC的影響

表5　非諾貝特和吡格列酮對AA大鼠BMC的影響　g/cm

2.3 PPAR激動劑對細胞因子的表達RT-PCR法檢測滑膜組織中IL-1β和IL-6mRNA的表達水平，模型對照組中IL-1β和IL-6的表達均高于空白組，非諾貝特和吡格列酮可使AA大鼠IL-1β和IL-6mRNA的表達降低。模型對照組中IL-10的含量顯著低于正常組，連續給藥21 d后，非諾貝特和吡格列酮可顯著提高IL-10mRNA水平的表達量。見圖6，表6。

圖6　非諾貝特和吡格列酮對IL-1β、IL-6和IL10mRNA表達的影響

表6　非諾貝特和吡格列酮對IL-1β、IL-6和IL-10mRNA表達的影響

3　討論

貝特類降脂藥和格列酮類降糖藥分別被確認為是PPAR-α和PPAR-γ的特異性激活劑，同時它們對炎癥反應的控制作用，也逐漸引起了人們的重視［7］。有關PPAR-α和PPAR-γ激活劑在關節炎中的抗炎作用報道極少。類風濕關節炎(RA)是關節和關節周圍組織，以非化膿性炎癥為主的慢性自身免疫性疾?。?］。早期表現為關節明顯腫脹，滑膜紅腫，多侵犯小關節如手、腕和足，對稱性發生較多見。AA動物模型于是目前研究RA應用較為廣泛的動物模型，普遍認為AA在臨床表現、血清學特點和病理改變等方面與RA非常相似，是研究、篩選治療RA藥物常用的模型之一。IL-lβ是一種在RA患者關節滑液、滑膜組織和血液中均可測到的促炎因子［9］。IL-6是RA患者滑膜組織中存在較為廣泛的細胞因子，主要來源于成纖維樣滑膜細胞和B型滑液襯細胞，因此它的釋放與關節損傷直接相關［10］。IL-10是體內最主要的抑炎性細胞因子，主要由Th2細胞、單核/巨噬細胞等分泌，抑制單核巨噬細胞的激活、粘附與遷移及炎癥因子的合成和釋放，減輕全身及關節局部炎癥反應［11］。

本研究中，非諾貝特100mg·kg－1·d－1、吡格列酮30mg·kg－1·d－1可降低關節炎的嚴重程度，如腫脹度和關節炎指數評分，并使AA大鼠體重上升。雙能X線骨密度儀檢測全身及ROI區BMD和BMC的變化，非諾貝特組全身及ROI區BMD較模型對照組明顯改善，吡格列酮組與模型對照組無顯著性差別。非諾貝特和吡格列酮治療后，AA大鼠BMC含量明顯增加。同時，非諾貝特和吡格列酮可使AA大鼠IL-1β 和IL-6mRNA的表達水平降低，顯著提高IL-10mRNA的表達水平。綜上所述，本研究結果提示非諾貝特和吡格列酮對大鼠佐劑性關節炎具有一定的治療作用，為其臨床用治療類風濕性關節炎提供有力的實驗基礎。

參考文獻

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