烏丹降脂膠囊對NAFLD模型SD大鼠體內Treg細胞的影響

金鵬　楊莉　賈彥生　張志

烏丹降脂膠囊對NAFLD模型SD大鼠體內Treg細胞的影響

金鵬楊莉賈彥生張志

【摘要】目的探討烏丹降脂膠囊對大鼠非酒精性脂肪肝(NASH)模型外周血中Treg細胞和相關細胞因子額含量，探討烏丹降脂膠囊對Treg細胞的影響。方法40只SPF級SD大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、易善復組、烏丹降脂膠囊組，正常對照組以基礎飼料喂飼，其他三組連續16周通過高脂飼料喂飼，建立非酒精性脂肪肝病模型，同時正常對照組、模型對照組，以生理鹽水10ml/(kg·d)灌胃;易善復組以易善復溶液灌胃10ml/(kg·d);烏丹降脂膠囊組以烏丹降脂膠囊灌胃10ml/(kg·d);連續灌胃14周后，檢測全血Treg細胞的表達量及血清IL-6、IL-10 及TGF-β1的含量。結果與正常對照組相比，模型組Treg細胞的表達量及血清IL-6、IL-10及TGF-β1的含量均升高;與模型組相比，烏丹降脂膠囊組及易復善組Treg細胞的表達量及血清IL-6、IL-10及TGF-β1的含量均明顯降低，且差異有統計學意義(P＜0.05)。結論烏丹降脂膠囊可能通過抑制炎癥的發生使Treg細胞及其相關細胞因子表達量降低，從而對Treg細胞的功能紊亂進行調節。

【關鍵詞】烏丹降脂膠囊; Treg細胞;血清IL-6; IL-10; TGF-β1;細胞因子

【中圖分類號】R 975

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002－7386(2015)16－2433－03

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.16.009

收稿日期:(2015－02－13)

項目來源:河北省中醫藥管理局科學技術研究計劃基金項目(編號:2012166);河北省科技廳科技計劃項目(編號:14277753D)

作者單位: 050021河北省石家莊市第五醫院

通訊作者:楊莉，050021河北省石家莊市第五醫院;

E-mail: yangli_yl6666@126.com

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是臨床中較為常見的肝病，有資料顯示，隨著人民生活水平的提高及實驗室檢查的普及，脂肪肝的發病率不斷上升，非酒精性脂肪肝(NAFLD)在我國已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病［1］。NAFLD發生發展的分子機制尚不完全清楚，目前最成熟的假說是Day提出的“二次打擊”學說［2］，但并不能圓滿解釋NAFLD的所有臨床現象。近年來，越來越多的研究表明NAFLD的發生發展過程存在免疫微環境的變化，調節性T細胞(CD4+CD2+5regulatory Tcell，Treg)的異常可能是其病理機制之一，但是中藥治療脂肪肝時對Treg細胞的影響的研究較少見。烏丹降脂膠囊(冀藥制字Z20051051)，是石家莊市第五醫院自行研制的用于脂肪肝的治療藥物，經多年臨床觀察療效顯著。本研究通過大鼠非酒精性脂肪肝模型研究烏丹降脂膠囊在非酒精性脂肪肝形成中對Treg細胞及其相關細胞因子的影響，從免疫微環境方面探討烏丹降脂膠囊治療脂肪肝的作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物SD大鼠40只，雄性，無特定病原體級(SPF)，體重(200±20)g，由河北醫科大學實驗動物中心提供，合格證號:1302094。

1.2飼料與藥物基礎飼料:由河北醫科大學實驗動物中心加工生產;高脂飼料配方:膽固醇2%，豬油10%，基礎飼料88%;烏丹降脂膠囊:石家莊市第五醫院臨床治療脂肪肝的經驗方，由石家莊市第五醫院制劑室提供，冀藥制字: Z20051051;易善復由賽諾菲安萬特公司生產，國藥準字: HZ20109010。

1.3實驗試劑及主要儀器檢測血清白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)和轉化生長因子-β1(TGF-β1)的ELISA試劑盒由R＆D公司生產，主要檢測儀器為芬蘭Thermo公司產MK3型全自動酶標儀，所用流式抗體均購自Biolegend公司，FOXP3 FIX/ Prem Buffer Set、FOXP3＆PERM Kit(破膜劑)均購自Liankebio公司，流式細胞儀為BD公司的

1.4實驗動物造模方法及標本留取40只SD大鼠隨機分為4組，每組10只，分別為正常對照組、模型對照組、易善復組和烏丹降脂膠囊組。正常對照組以基礎飼料喂食，而模型對照組、易善復組和烏丹降脂膠囊組則以高脂飼料喂飼，連續喂養2周后，正常對照組、模型對照組以0.9%氯化鈉溶液10ml·kg－1·d－1灌胃;易善復組以易善復溶液(將易善復用雙蒸水配制成8.523 g/L的溶液)10ml·kg－1·d－1灌胃;烏丹降脂膠囊組以烏丹降脂膠囊溶液(將烏丹降脂膠囊用雙蒸水配置成41.667 g/L的溶液)10ml·kg－1·d－1灌胃，連續灌胃14周。實驗結束后，3%戊巴比妥鈉(0.15ml/100 g)腹腔注射麻醉，無菌采集外周靜脈血，凝固后2 000 r/min離心10min，分離血清備用，同

時保留1ml EDTA抗凝血備用。

1.5大鼠外周血Treg細胞表達量的檢測取100 μl抗凝全血加至流式管中，分別加入抗體CD4-PE-CY7、CD25-FITC各5 μl，混勻，室溫避光孵育15min加入PBS 1ml，1 500 r/m離心5min，棄上清;加入A液(破膜劑A)100 μl，室溫避光孵育15min，1 500 r/m離心5min，棄上清;加入Foxp3 Fix/Prem Buffe 3ml，1 500 r/m離心5min;加入B液(破膜劑B)100 μl及Foxp3mAb-PE10～20 μl，混勻，室溫孵育20min，加入Foxp3 Fix/Prem Buffe 3ml，1 500 r/m離心5min，棄上清;加入PBS 500 μl重懸細胞，上流式細胞儀檢測(CD4+CD25+Foxp3+)Treg細胞表達量。

1.6血清IL-10、IL-6和TGF-β1的檢測采用ELISA法測定血清中IL-10、IL-6和TGF-β1的含量，嚴格按說明書操作。

2　結果

2.1 Treg細胞表達量的檢測與正常對照組相比，模型組，易善復組的Treg細胞表達量明顯升高，差異有統計學意義(P = 0.001，0.004)，烏丹降脂膠囊組雖亦升高，但差異無統計學意義(P =0.779);與模型組相比，易善復組、烏丹降脂膠囊組的Treg細胞表達量均明顯降低，烏丹降脂膠囊組降低的差異有統計學意義(P =0.096，0.001)。見表1及圖1。

2.2 4組血清IL-6的含量與正常對照組相比，模型組，易善復組的血清中IL-6的含量均升高，烏丹降脂膠囊組則降低，但是4組之間差異不顯著。見表1。

2.3 4組血清IL-10的含量與正常對照組相比，模型組血清IL-10的含量明顯升高，差異具有顯著性(P =0.046);與模型組相比，易善復組、烏丹降脂膠囊組血清IL-10的含量均明顯降低，差異具有顯著性(P = 0.041，0.006)。見表1。

2.4 4組血清TGF-β1的含量與正常對照組相比，模型組血清TGF-β1的含量明顯升高，易善復組則明顯降低，差異有統計學意義(P =0.001，0.047)，烏丹降脂膠囊組血清TGF-β1的含量亦降低，差異無統計學意義(P = 0.223);與模型組相比，易善復組、烏丹降脂膠囊組血清TGF-β1的含量均明顯降低，差異有統計學意義(P =0.001，0.001)。見表1。

表1　4組大鼠外周血中Treg細胞表達量及細胞因子的含量

圖1　(CD+4CD+25Foxp3+)Treg細胞流式細胞術檢測示意圖

3　討論

根據NAFLD的臨床表現，應屬于中醫學的“肝癖”、“脅痛掣、積聚”等范疇［3］。目前很多研究顯示臨床工作者將辨病與辨證相結合，遣方用藥，有效地改善了非酒精性脂肪肝患者的肝功能、臨床癥狀等，取得了滿意的臨床效果。雖然中醫藥在研究本病防治方面具有不可忽視的潛力，但是實驗研究起步較晚，對中醫藥的療效機制的研究較為欠缺。本研究中的烏丹降脂膠囊的生山楂可消食導滯，化痰消積，陳皮可以健脾燥濕化痰，半夏可以燥濕化痰，消痞散結，丹參可活血祛瘀的作用，從中醫的角度來看具有健脾化痰、活血化瘀的功效，有利于脂肪肝的治療。近年來免疫系統在NASH發病中的作用越來越受到重視，CD+4CD+25。

Treg是目前研究最多的一群調節性T細胞，它是一類具有免疫調節作用的細胞群，可通過細胞接觸依賴機制或細胞因子(如IL-10或TGF-β等)機制發揮抑

制免疫T細胞活化、維持免疫耐受以及防止免疫性疾病發生的作用［4］。Foxp 3對于CD4+CD2+5Treg的生長發育和功能維持起著重要的作用，因此，CD4+CD2+5Foxp3+Treg細胞表達量的檢測更能反應機體內Treg細胞的功能狀態。本研究中與正常對照組相比，模型組的CD4+CD2+5Foxp3+Treg細胞表達量明顯升高，這和程瑗［5］的臨床研究一致，表明在NAFLD形成中，確實存在Treg細胞的功能紊亂，或許為了發揮保護機體避免更嚴重損傷，抑制過激的炎性反應的作用，Treg細胞不斷增高，抑制T細胞的細胞毒作用，但這可能也同時造成了低度炎性反應狀態的持續，并造成Th1/ Th2平衡紊亂。烏丹降脂膠囊組及易善復組的CD4+CD2+5Foxp3+Treg的表達量與模型組相比明顯降低，尤其烏丹降脂膠囊組的表達量與正常對照組差異不大，由此可見烏丹降脂膠囊的使用可調節脂肪肝機體內Treg細胞的功能紊亂。

Treg通過分泌IL-4、IL-10和TGF-β，參與自身免疫性疾病、移植免疫、腫瘤免疫等［6］IL-10和TGF-β1為抗炎性細胞因子，在本研究中顯示模型組IL-10和TGF-β1的含量比正常對照組明顯升高，可見CD4+CD2+5Foxp3+Treg細胞通過這兩種細胞因子來執行抑制炎癥的功能，亦有人提出Treg可通過分泌轉化生長因子(TGF-β)以及細胞直接接觸，與作為抗原提呈細胞的各種免疫細胞(如肝臟局部的肝星狀細胞)發揮直接作用，Treg亦有可能是促進肝臟纖維化甚至其他系統功能失代償的“幫兇”［5］，表明Treg細胞分泌的TGF-β的升高也可能是促進脂肪肝形成肝纖維化機制之一。本研究顯示烏丹降脂膠囊可以使大鼠體內這兩種細胞因子的含量明顯降低，甚至低于正常對照組，由此可見烏丹降脂膠囊組可以明顯抑制Treg細胞促進肝纖維化形成的作用但是也同時降低了Treg細胞通過細胞因子發揮的免疫抑制功能。

Treg細胞主要是抑制免疫應答的作用，那么Treg細胞的減少，炎癥反應會不會嚴重，IL-6是一種廣泛表達具有多種功能的炎性因子。IL-6能抑制脂蛋白酶的活性，抑制脂肪分解，使脂肪儲存增加，循環中TG水平升高，進而促進脂肪肝的形成［7］。在本研究中雖然四組體內IL-6的含量差異不顯著，但是與正常對照組相比，模型組升高的較多，而烏丹降脂膠囊組則低于正常對照組，由此可見烏丹降脂膠囊對IL-6的產生起抑制作用，從而阻止脂肪肝的形成。由此可見烏丹降脂膠囊可以抑制肝臟炎癥發生的作用，那么是否由于肝臟炎癥減輕，使Treg細胞的表達量明顯降低，亦阻止了Treg細胞促進脂肪肝形成肝纖維化的功能，這需要我們進一步研究。

總之，烏丹降脂膠囊可以調節Treg細胞的功能紊亂，且這方面功能明顯強于易善復，中藥的作用是多靶點的，可見調節Treg細胞的功能亦是烏丹降脂膠囊作用機制之一，只是它在抑制脂肪肝進展中的作用機制還需要我們進一步研究，為中藥治療NAFLD探索新的思路。

參考文獻

1鄭全喜，王昆，劉超.菲酒精性脂肪肝肝病動物模型的研究進展.中國實驗方劑學雜志，2013，19:357.

2 Day CP，James O.Steatohepatitis: a tale of two“hits”? Gastroenterology，1998，114:842-845.

3喬娜麗，楊欽河，紀桂元，等.論肝郁脾虛是脂肪肝的基本發病病機.時珍國醫國藥，2008，19:1238-1239.

4 Wing K，Fehérvári Z，Sakaguchi S.Emerging possibilities in the development and function of regulatorytcells.Int Immunol，2006，18: 991-1000.

5程瑗，陳永平，金曉芝，等.非酒精性單純性脂肪肝患者外周血CD4+CD25 +調節性T細胞數量變化及臨床意義.中華傳染病雜志，2012，30:43-47.

6 Wing K，Fehérvári Z，Sakaguchi S.Emerging possibilities in the development and function of regulatorytcells.Int Immunol，2006，18: 991-1000.

7陳靜英，藍顯明，張雪芳，等.當歸注射液治療大鼠非酒精性脂肪肝的實驗研究.北方藥學，2014，11:77-78.