糖尿病大鼠結腸動力變化及其機制探討

張惠潔，吳泉霞，趙勱，譚至柔，秦荔榮，黃雪

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021)

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糖尿病大鼠結腸動力變化及其機制探討

張惠潔，吳泉霞，趙勱，譚至柔，秦荔榮，黃雪

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021)

摘要：目的觀察糖尿病(DM)大鼠結腸動力的變化，并探討其機制。方法將34只SD大鼠隨機分為3組，觀察組和模型組制作DM模型，觀察組于造模6周后每天皮下注射甘精胰島素8 U/kg，對照組和模型組均注射等量生理鹽水。干預4周后處死各組大鼠，剖腹取出全部腸道測量腸道推進率，免疫組化法檢測各組近端結腸Cajal間質細胞(ICC)、縫隙連接蛋白43(Cx43)，透射電鏡觀察近端結腸的超微結構。結果觀察組腸道推進率高于模型組，模型組低于對照組，P均<0.05。結腸組織ICC及Cx43表達均為對照組高于觀察組、觀察組高于模型組，P均<0.05。觀察組ICC數量、細胞間縫隙連接明顯多于模型組,但少于對照組。結論DM大鼠存在結腸動力障礙，可能與結腸組織ICC數量減少、細胞間縫隙連接破壞及Cx43表達降低有關；甘精胰島素可抑制上述改變，改善結腸動力。

關鍵詞：糖尿病；結腸動力障礙；Cajal間質細胞；縫隙連接蛋白43

胃腸動力障礙是糖尿病(DM)常見的慢性并發癥[1]，其機制目前尚不完全清楚。近年研究發現，DM胃腸動力障礙與Cajal間質細胞(ICC)的減少和細胞間通訊功能障礙有關。ICC 是胃腸道平滑肌細胞間的起搏細胞，可產生自發性慢波并介導神經遞質傳遞。ICC之間及ICC與平滑肌細胞之間的信號傳遞由縫隙連接(GJ) 介導是細胞間信息通訊的主要通道。縫隙連接蛋白(Cx)是GJ 的基本構成部分，Cx43是目前發現的最重要的Cx。2014年3～8月，我們觀察了DM大鼠結腸動力變化，并探討其作用機制。現報告如下。

1材料與方法

1.1材料SPF級SD大鼠34只，體質量160～180 g，雌雄各半，由廣西醫科大學動物實驗中心提供(許可證號：scxk桂2009-0002)。c-Kit兔多克隆抗體(sc-168，武漢博士德公司)；兔多克隆Cx43抗體(武漢博士德公司)；SP試劑盒(SP-9000，北京中杉金橋生物公司)；DAB顯色試劑盒(ZLI-9031，北京中杉金橋生物公司)；鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)用0.1 mmol/L、pH 4.4檸檬酸緩沖液配制后備用；德國羅氏活力型血糖儀(配套試紙)；注射甘精胰島素(諾和諾德中國制藥有限公司)。

1.2動物分組及處理取24只SD大鼠采用一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg制作DM模型，測得血糖≥16.7 mmol/L且能穩定維持1 周以上者為造模成功。最終造模成功納入19只，將其分為觀察組10只和模型組9只，取10只正常SD大鼠為對照組。觀察組于造模6周后每天皮下注射甘精胰島素8 U/kg，模型組和對照組注射等量生理鹽水，持續4 周。

1.3腸道推進率測定干預4周后禁食16 h，經口灌入0.01%的美藍溶液2 mL，30 min后頸髓脫臼法處死大鼠；剖腹取出從幽門到直腸末端全部腸道，在無張力狀態下測量腸道全長及美藍溶液在腸道的推進距離，計算腸道推進率(腸道推進率=美藍推進距離/腸道全長×100%)。因大鼠結腸較短，因此本研究以全腸腸道推進率代表結腸推進率。

1.4 結腸組織ICC、 Cx43表達測定采用免疫組化法。剪取各組大鼠近端結腸(距盲腸2 cm)組織長約0.5 cm，常規固定、包埋、切片，脫蠟；抗原修復、過氧化氫滅活、血清封閉，分別滴加c-Kit一抗(1∶50稀釋)、Cx43一抗(1∶100稀釋)各50 μL，4 ℃過夜；先后滴加生物素標記的二抗及辣根過氧化酶各50 μL，室溫孵育15 min；DAB顯色，復染，沖洗、封片，顯微鏡觀察。結腸組織ICC主要分布于黏膜下環行肌層表面、環行肌層與縱行肌層之間、環行肌層和縱行肌層內，以環行肌層和肌間神經叢區域最明顯；Cx43主要分布在環行肌與縱行肌之間和環行肌層外表面。以胞膜上或胞質內出現棕黃色片狀或顆粒狀物為陽性反應。應用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，計算各組累計光密度值(IOD)。

1.5結腸組織超微結構觀察 取各組約1 cm近端結腸組織，戊二醛固定。經前固定、后固定、塊染、脫水、浸漬后包埋成塊，光學顯微鏡下半薄切片;用亞甲藍染色定位，確定組織分層后，LKB-Ⅱ超薄切片機切片;保留環形肌、縱形肌及部分黏膜層，用日立H7650透射電子顯微鏡觀察ICC細胞數目及GJ情況。

2結果

2.1各組腸道推進率比較觀察組、模型組、對照組腸道推進率分別為64.68%±1.85%、54.51%±2.34%、71.15%±2.60%，觀察組腸道推進率高于模型組、模型組低于對照組，P均<0.05。

2.2各組結腸組織ICC及 Cx43表達比較詳見表1。

表1　各組結腸組織ICC及 Cx43表達比較

注：與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。

2.3各組結腸組織超微結構比較對照組ICC細胞形態數量較多，基膜完整，胞核大，呈圓形或卵圓形；細胞質較少，胞質和突起內含有豐富的細胞器，滑面內質網發達，粗面內質網數目較少，高爾基體發育良好，線粒體豐富，緊密排列在胞質里。細胞間存在大量緊密GJ。模型組ICC數量明顯減少，基膜溶解，部分基膜與細胞膜分離，形成空泡；胞質廣泛溶解，胞質內空泡數目較多，胞質內細胞器數量明顯減少，線粒體腫脹、空泡樣變，內質網擴張，粗面內質網部分脫顆粒；細胞間的GJ明顯減少，尚存細胞間連接結構不清，連接松散。觀察組ICC數目、GJ均多于模型組，但少于對照組。

3討論

DM發病率逐年升高，且呈年輕化趨勢[2]，胃腸動力障礙是其常見慢性并發癥，而DM結腸動力障礙又是常見表現之一。DM結腸動力障礙臨床特征為腹脹和便秘，病理生理特點為結腸張力和收縮力降低，蠕動減慢，排空延遲，嚴重影響患者的生活質量及口服降糖藥的效果。目前，其病理生理學基礎尚不完全清楚。

ICC是胃腸慢波的起搏細胞，具有產生慢波、傳導慢波電位、介導神經遞質傳遞等功能，在維持正常胃腸動力方面發揮著重要作用[3]。近年研究發現，多種胃腸動力障礙性疾病如賁門失弛緩癥[4]、先天性巨結腸[5]、慢傳輸型便秘[6]等均存在ICC形態、分布及數量的異常，ICC數量減少可導致結腸起搏功能減弱，平滑肌產生異常的不規則慢波、收縮功能障礙、蠕動減少或不能產生有效的推進性收縮運動[7]。GJ又稱通訊連接，對細胞的新陳代謝、內環境穩定、增殖和分化等生理過程起重要調控作用[8]。Cx43是人類主要縫隙連接蛋白[9],其表達異常與多種疾病的發生有關[10，11]。研究發現，Cx43基因具有腫瘤抑制性，多種癌細胞中均存在Cx43的低表達[12]。Cx43與胃腸運動密切相關，Cx43廣泛存在ICC之間、ICC與平滑肌細胞(SMC)之間及SMC與SMC之間，ICC、ICC與SMC可通過GJ形成三維網絡結構和功能上的電偶聯體，產生興奮或抑制性反應[13]。本研究發現，各組結腸組織ICC、 Cx43表達均為對照組高于觀察組，觀察組高于模型組。說明細胞間連接通訊破壞，引起胃腸神經末梢-ICC-SMC之間的信息和物質傳遞障礙，電傳導減弱；ICC作為結腸運動的起搏細胞和介導神經遞質的功能顯著下降，進一步導致腸道神經系統對SMC的調節減弱，從而引起結腸運動功能障礙。

研究發現,DM胃腸動力障礙時胰島素分泌減少[14]，可導致DM相關ICC缺失，胰島素可能通過促進胃腸SMC生長、抑制其凋亡、誘導其表達干細胞因子，對ICC起保護作用[15，16]。其可能作用機制為胰島素通過PI3K/Akt和Ras/MAPK兩條信號轉導通路實現[17～19]。但其具體機制尚有待于進一步研究。

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收稿日期：(2015-09-01)

通信作者：譚至柔

基金項目：廣西自然科學基金資助項目(2010GXNSFA013143)。

中圖分類號：R574.4

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)46-0025-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.46.009