紅花細胞培養物化學成分研究

譚圳，陳日道，解可波，楊林，戴均貴

·論著·

紅花細胞培養物化學成分研究

譚圳，陳日道，解可波，楊林，戴均貴

目的研究紅花細胞培養物的化學成分。

方法采用固體 MS 培養基，對紅花細胞進行放大培養，通過硅膠柱色譜、Sephadex LH-20 凝膠柱色譜、半制備HPLC 等方法對紅花細胞培養物的化學成分進行分離純化，質譜和核磁共振等波譜方法進行化學成分的結構鑒定。

結果從紅花細胞培養物中分離并鑒定了 12 個化合物，分別是豆甾-5-烯-3β，7β-二醇、豆甾-5-烯-3β，7α-二醇、豆甾-5，22-二烯-3β，7β-二醇、豆甾-5，22-二烯-3β，7α-二醇、十六烷酸甘油酯、丁香酸甲酯、3，5-二甲氧基-對羥基苯甲醛、對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸、N-阿魏酸酰-對羥基苯乙胺、芥子酸乙酯、丁香脂素。

結論化合物豆甾-5-烯-3β，7β-二醇、豆甾-5-烯-3β，7α-二醇、豆甾-5，22-二烯-3β，7β-二醇、豆甾-5，22-二烯-3β，7α-二醇、丁香酸甲酯、3，5-二甲氧基-對羥基苯甲醛、N-阿魏酸酰-對羥基苯乙胺、芥子酸乙酯均為首次從紅花植物中分離得到。

紅花；細胞培養技術；化學成分

www.cmbp.net.cn中國醫藥生物技術， 2016， 11（4）：319-323

菊科植物紅花（Carthamus tinctorius L.）是常用中藥，始載于《開寶本草》，其花入藥，具有活血祛瘀、通經止痛等功效［1］。現代藥理實驗證明紅花的化學成分具有抗乳腺癌、抗肝癌、抗焦慮和抗抑郁、抗糖尿病、抗心肌缺血和舒張血管、鎮痛和抗炎等藥理活性［2-8］。盡管紅花作為一種名貴藥用植物已大量栽培，但需要大量的土地，且球腐病、葉斑病、根腐病等病害影響著紅花的生產與質量。為了減少對土地資源的依賴以及病蟲害，獲得質量穩定的紅花產物，采用植物組織細胞培養技術進行紅花藥用化學成分的生物合成甚至大規模生產是切實可行的途徑。雖然已有紅花組織培養和快速繁殖等方面的研究報道［9-11］，但目前對紅花細胞培養物中化學成分的系統研究較少。本研究組建立了紅花細胞培養體系，并進一步對其化學成分進行較為系統的研究。利用多種色譜方法從紅花細胞培養物中分離得到 12 個化合物，通過質譜和核磁共振波譜等方法對其結構進行了鑒定，現報道如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1植物細胞紅花由本實驗室誘導，繼代培養，并保藏于本實驗室。

1.1.2儀器VNMR SYSTEM-400 型核磁共振波譜儀為美國 Varian 公司產品；AVIIIHD 500 MHz 和 AVIIIHD 600 MHz 核磁共振波譜儀為美國Bruker 公司產品；1200 分析型高效液相系統為美國 Agilent 公司產品；Q-TOFLC/MS 質譜儀為美國Thermo 公司產品；LC-20AT 半制備高效液相儀為日本島津公司產品；YRU-883A RI 檢測器為日本Shiseido 公司產品；反相半制備色譜柱 GRACE C18（10 mm × 250 mm，5 μm）為美國 Alltech Associates 公司產品；正相半制備色譜柱 YMC Silica（10 mm × 250 mm，5 μm）為日本 YMC 公司產品。

1.1.3試劑分析純乙醇、甲醇、乙酸乙酯、正己烷、丙酮、石油醚、氯仿為北京化工廠生產；色譜級甲醇為美國 Sigma 公司生產；Sephadex LH-20由瑞典 Amersham Bioscience 公司生產；柱色譜硅膠（200 ～ 300 目和 60 ～ 100 目）和 GF254硅膠板均為青島海洋化工廠產品。

1.1.4細胞培養基MS 培養基：NH4NO31.65 g/L、KNO31.90 g/L、KH2PO40.17 g/L、MgSO4·7H2O 0.37 g/L、CaCl2·H2O 0.44 g/L、KI 0.83 mg/L、H3BO36.20 mg/L、CoCl2·6H2O 0.025 mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L、MnSO4·4H2O 22.30 mg/L、CuSO4·5H2O 0.025 mg/L、ZnSO4·7H2O 8.60 mg/L、FeSO4·7H2O 27.80 mg/L、EDTA-Na237.30 mg/L、肌醇 100 mg/L、VB60.50 mg/L、VB10.10 mg/L、甘氨酸 2 mg/L、煙酸 0.50 mg/L、蔗糖 40 g/L，并調 pH 5.8。

1.2方法

1.2.1細胞培養紅花愈傷組織為選用種子萌發后的無菌苗葉片經 MS 培養基、0.5 mg/L α-萘乙酸（α-naphthalene acetic acid，NAA）、0.5 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-benzyl aminopurine，6-BA）和 0.2 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D）誘導產生。產生的愈傷組織在固體 MS 培養基附加 1.0 mg/L 2，4-D、1.0 mg/L NAA 及 1.0 mg/L 6-BA 黑暗靜置培養 30 d 后，收集細胞培養物，于60 ℃ 下烘干。

1.2.2提取分離紅花干燥細胞培養物 380.0 g 用 75% 乙醇回流提取 3 次，每次 6 h，合并提取液并減壓濃縮成浸膏（80.0 g）。浸膏用熱水 1.5 L分散，依次用石油醚 2.0 L、乙酸乙酯 2.0 L、正丁醇 2.0 L 萃取 3 次，得到石油醚部分 7.3 g，乙酸乙酯部分 9.8 g，正丁醇部分 25.4 g。

石油醚部分經硅膠柱色譜（200 ～ 300 目）分離，依次用石油醚-丙酮（1∶0、20∶1、8∶1、4∶1、1∶1、0∶1）系統梯度洗脫得到 9 個流分（Fr.1 ～Fr.9）。流分 Fr.6（495.6 mg）經正相半制備 HPLC（正己烷∶乙酸乙酯 = 7∶3，v/v，流速 4.0 ml/min）后再經反相半制備 HPLC（甲醇∶水 = 92∶8，v/v，流速 3.0 ml/min）純化得到化合物 1（1.4 mg，tR= 46.5 min）和化合物 3（1.5 mg，tR= 41.0 min）。流分 Fr.7（303.6 mg）經正相半制備 HPLC（正己烷∶乙酸乙酯 = 8∶2，v/v，流速 4.0 ml/min）、反相半制備 HPLC（甲醇∶水 = 94∶6，v/v，流速 3.0 ml/min）純化得到化合物 2（0.6 mg，tR= 27.5 min）、化合物 4（1.0 mg，tR= 24.4 min），流分 Fr.7（303.6 mg）經正相半制備 HPLC（正己烷∶乙酸乙酯 = 8∶2，v/v，流速 4.0 ml/min）后再經反相半制備 HPLC（甲醇∶水 = 85∶15，v/v，流速 3.0 ml/min）純化得到化合物 5（1.5 mg，tR= 31.5 min）。

乙酸乙酯部分通過硅膠柱色譜（200 ～ 300 目）分離，依次以石油醚-丙酮（9∶1、8∶2、7∶3、5∶5、3∶7、0∶1）系統梯度洗脫得到 18 個流分（Fr.1 ～Fr.18），流分 Fr.2（195.6 mg）經過正相半制備 HPLC（正己烷∶乙酸乙酯 = 8∶2，v/v，流速 4.0 ml/min）、反相半制備 HPLC（甲醇∶水 = 25∶75，v/v，流速3.0 ml/min）純化得到化合物 7（3.0 mg，tR= 45.3 min）和 8（1.2 mg，tR= 24.6 min）；經反相半制備 HPLC（甲醇∶水 = 50∶50，v/v，流速 3.0 ml/min，甲醇∶水 = 40∶60，v/v，流速 3.0 ml/min）純化得到化合物 6（1.0 mg，tR= 28.5 min），11（0.9 mg，tR= 36.2 min）。流分 Fr.5（852.7 mg）經過凝膠柱層析（甲醇∶氯仿 = 1∶1，v/v）、正相半制備HPLC（正己烷∶乙酸乙酯 = 7∶3，v/v，流速 4.0 ml/min，正己烷∶乙酸乙酯 = 5∶5，v/v，流速 4.0 ml/min）純化得到化合物 9（9.4 mg，tR= 5.9 min）。流分 Fr.7 （1.4 g）經過硅膠柱色譜（200 ～ 300 目）分離，依次以石油醚-丙酮（7∶3、6∶4、4∶6、0∶1）系統梯度洗脫得到 8 個流分（Fr.7-1 ～ Fr.7-8），流分 Fr.7-2 （550.0 mg）經過正相半制備 HPLC（正己烷∶乙酸乙酯 = 55∶45，v/v，流速 4.0 ml/min）、反相半制備 HPLC（甲醇∶水 = 45∶55，v/v，流速 3.0 ml/min）和正相半制備 HPLC（正己烷∶乙酸乙酯 = 47∶53，v/v，流速 4.0 ml/min）HPLC 純化得到化合物 10 （31.0 mg，tR= 27.8 min）；經反相半制備 HPLC（乙腈∶水 = 36∶64，v/v，流速 3.0 ml/min）純化得到化合物 12（51.1 mg，tR= 23.3 min）。

2　結果

化合物 1 為無色膠狀物，ESI-MS m/z 430.96 ［M + H］+；1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ∶5.29（1H，s，H-6），3.85（1H，d，J = 8.0 Hz，H-7），3.55（1H，m，H-3），1.05（3H，s，H-19），0.93（3H，d，J = 6.4 Hz，H-21），0.85（3H，t，J = 7.6 Hz，H-29），0.83（3H，d，J = 7.2 Hz，H-26），0.82（3H，d，J = 7.2 Hz，H-27），0.70（3H，s，H-18）。13C-NMR （CDCl3，125 MHz）δ∶143.5（C-5），125.5（C-6），73.4（C-7），71.5（C-3），56.2（C-17），55.3（C-14），48.3（C-9），45.8（C-24），42.9（C-13），41.7（C-4），40.9（C-8），39.5（C-12），36.9（C-1），36.4（C-10），36.0（C-20），34.0（C-22），31.6（C-2），29.2（C-25），28.4（C-16），26.4（C-15），26.3（C-23），23.0（C-28），21.1（C-11），19.7（C-26），19.1（C-19），18.9（C-27），18.8（C-21），12.0（C-29），11.8（C-18）。以上數據與文獻［12］中一致，故鑒定為豆甾-5-烯-3β，7β-二醇。

化合物 2 為無色膠狀物，ESI-MS m/z 430.91 ［M + H］+；1H-NMR （CDCl3，400 MHz）δ∶5.61（1H，d，J = 3.6 Hz，H-6），3.85（1H，br s，H-7），3.59 （1H，m，H-3），1.10（3H，s，H-19），0.93（3H，d，J = 6.8 Hz，H-21），0.84（3H，t，J = 8.4 Hz，H-29），0.83（3H，d，J = 6.8 Hz，H-26），0.81（3H，d，J = 6.8 Hz，H-27），0.69（3H，s，H-18）。13C-NMR （CDCl3，125 MHz）δ∶146.3（C-5），123.9（C-6），71.4（C-3），65.4（C-7），55.7（C-17），49.4（C-14），45.8（C-24），42.3（C-9），42.2（C-13），42.0（C-4），39.2（C-12），37.5（C-8），37.4（C-10），37.0（C-1），36.1（C-20），33.9（C-22），31.4（C-2），29.1（C-25），28.3（C-16），26.0（C-23），25.9（C-15），23.0（C-28），20.7（C-11），19.8（C-26），19.0（C-27），18.8（C-21），18.3（C-19），12.0（C-29），11.7（C-18）。以上數據與文獻［12］中一致，故鑒定為豆甾-5-烯-3β，7α-二醇。

化合物 3 為白色粉末，ESI-MS m/z 411.33 ［M + H - H2O］+，1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ∶5.29 （1H，s，H-6），5.16（1H，dd，J = 8.8，15.2 Hz，H-22），5.03（1H，dd，J = 8.8，15.2 Hz，H-23），3.85（1H，d，J = 7.6 Hz，H-7），3.55（1H，m，H-3），1.05（3H，s，H-19），1.03（3H，d，J = 6.4 Hz，H-21），0.85（3H，t，J = 6.0 Hz，H-29），0.80 （6H，d，J = 6.4 Hz，H-26，27），0.71（3H，s，H-18）。13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ∶143.4（C-5），138.1（C-22），129.5（C-23），125.4（C-6），73.3 （C-7），71.4（C-3），56.0（C-17），55.3（C-14），51.2（C-24），48.2（C-9），42.9（C-13），41.7（C-4），40.8（C-8），40.3（C-20），39.5（C-12），36.9（C-1），36.4（C-10），31.8（C-25），31.5（C-2），29.2（C-16），26.4（C-15），25.4（C-28），21.3（C-11），21.3（C-21），21.1（C-27），19.0（C-19），18.8（C-26），12.3（C-29），12.0（C-18）。以上數據與文獻［13］中一致，故鑒定為豆甾-5，22-二烯-3β，7β-二醇。

化合物 4 為白色固體，ESI-MS m/z 411.32 ［M + H - H2O］+；1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ∶5.60 （1H，d，J = 3.2 Hz，H-6），5.17（1H，dd，J = 8.6，15.2 Hz，H-22），5.02（1H，dd，J = 8.5，15.2 Hz，H-23），3.85（1H，s，H-7），3.59（1H，m，H-3），1.03（3H，d，J = 6.4 Hz，H-21），1.00（3H，s，H-19），0.85（3H，t，J = 6.4 Hz，H-29），0.80（6H，d，J = 6.8 Hz，H-26，27），0.71（3H，s，H-18）。13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ：146.2（C-5），138.2 （C-22），129.3（C-23），123.8（C-6），71.3（C-3），65.3（C-7），55.7（C-17），51.2（C-24），49.4（C-14），42.3（C-9），42.2（C-13），42.0（C-4），40.4（C-20），39.1（C-12），37.5（C-8），37.4（C-10），37.0（C-1），31.9（C-25），31.3（C-2），28.9（C-16），25.4（C-28），24.3（C-15），21.2（C-21），21.1（C-27），20.7（C-11），19.0（C-26），18.2（C-19），12.3（C-29），11.8（C-18）。以上數據與文獻［14］中一致，故鑒定為豆甾-5，22-二烯-3β，7α-二醇。

化合物 5 為白色固體，ESI-MS m/z 331.17 ［M + H］+；1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ∶4.22（1H，dd，J = 4.4，12.0 Hz，H-3a），4.14（1H，dd，J = 6.0，12.0 Hz，H-3b），3.93（1H，m，H-2），3.70（1H，dd，J = 3.4，11.6 Hz，H-1a），3.60（1H，dd，J = 6.0，11.6 Hz，H-1b），2.34（2H，t，J = 7.5 Hz，H-5），1.10 ～ 1.70（26H，br s），0.88（3H，t，J = 6.1 Hz，H-19）。13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ∶174.4（C-4），70.2（C-2），65.1（C-3），63.3（C-1），34.1（C-5），22.7 ～ 31.9（C-6 ～ 18），14.1（C-19）。以上數據與文獻［15］中一致，故鑒定為十六烷酸甘油酯。

化合物 6 為淡黃色固體，ESI-MS m/z 213.09 ［M + H］+；1H-NMR（acetone-d6，400 MHz）δ∶7.30 （2H，s，H-2，6），3.88（6H，s，-OCH3× 2），3.84 （3H，s，-COOCH3）。13C-NMR（CDCl3，150 MHz）δ∶166.9（1-CO），146.7（C-3，5），139.2（C-4），121.2（C-1），106.7（C-2，6），56.5（3，5-OCH3），52.2（COOCH3）。以上數據與文獻［16］中一致，故鑒定為丁香酸甲酯。

化合物 7 為淡黃色固體，ESI-MS m/z 180.98 ［M + H］-；1H-NMR（acetone-d6，400 MHz）δ∶9.81 （1H，s，-CHO），7.23（2H，s，H-2，6），3.92 （6H，s，-OCH3× 2）。13C-NMR（acetone-d6，125 MHz）δ∶191.2（1-CHO），149.1（C-3，5），143.0 （C-4），129.2（C-1），107.8（C-2，6），56.7（3，5-OCH3）。以上數據與文獻［17］中一致，故鑒定為3，5-二甲氧基-對羥基苯甲醛。

化合物 8 為淡黃色固體，ESI-MS m/z 120.98 ［M + H］-；1H-NMR（acetone-d6，400 MHz）δ∶9.85 （1H，s，-CHO），7.80（2H，d，J = 8.0 Hz，H-2，6），7.01（2H，d，J = 8.0 Hz，H-3，5）。13C-NMR （acetone-d6，125 MHz）δ∶190.9（1-CHO），163.9 （C-4），132.7（C-2，6），130.3（C-1），116.6（C-3，5）。以上數據與文獻［18］中一致，故鑒定為對羥基苯甲醛。

化合物 9 為淡黃色固體，ESI-MS m/z 137.01 ［M + H］-；1H-NMR（acetone-d6，400 MHz）δ∶8.5 ～10.0（2H，br s，-OH，-COOH），7.92（2H，d，J = 8.1 Hz，H-2，H-6），6.92（2H，d，J = 8.1 Hz，H-3，H-5）。13C-NMR（acetone-d6，125 MHz）δ∶167.6 （1-COOH），162.6（C-4），132.3（C-2，6），122.7 （C-1），116.0（C-3，5）。以上數據與文獻［19］中一致，故鑒定為對羥基苯甲酸。

化合物 10 為黃色油狀，ESI-MS m/z 314.15［M + H］+；1H-NMR（acetone-d6，400 MHz）δ∶8.17 （1H，br s，-OH），8.14（1H，br s，-OH），7.97 （1H，d，J = 8.2 Hz，-NH），7.45（1H，d，J = 15.6 Hz，H-3），7.16（1H，s，H-5），7.06（2H，d，J = 8.0 Hz，H-4'，H-8'），7.04（1H，d，J = 8.3 Hz，H-9），6.83（1H，d，J = 8.3 Hz，H-8），6.76（2H，d，J = 8.0 Hz，H-5'，H-7'），6.50（1H，d，J = 15.6 Hz，H-2），3.88（3H，s，6-OCH3），3.49（2H，d，J = 6.8 Hz，H-1'），2.75（2H，t，J = 6.8 Hz，H-2'）。13C-NMR（acetone-d6，100 MHz）δ∶166.4（C-1），156.8（C-6'），149.2（C-6），148.7（C-7），140.4（C-3），131.3（C-3'），130.6（C-4'，C-8'），128.4（C-4），122.6（C-9），120.2（C-2），116.2（C-8，C-5'，C-7'），111.3（C-5），56.3（6-OCH3），42.0（C-1'），35.9 （C-2'）。以上數據與文獻［20］中一致，故鑒定為 N-阿魏酸酰-對羥基苯乙胺。

化合物 11 為淡黃色固體，ESI-MS m/z 252.98 ［M + H］+；1H-NMR（acetone-d6，400 MHz）δ∶7.57 （1H，d，J = 15.6 Hz，H-7），7.03（2H，s，H-2，H-6），6.41（1H，d，J = 15.6 Hz，H-8），4.20（2H，q，J = 7.1 Hz，H-10），3.90（6H，s，3-OCH3，5-OCH3），1.28（3H，t，J = 7.1 Hz，H-11）。13C-NMR（acetone-d6，100 MHz）δ∶167.5（C-9），149.1（C-3，C-5），146.0 （C-7），139.6（C-4），126.3（C-1），116.4（C-8），107.0（C-2，C-6），60.7（C-10），56.9（3-OCH3，5-OCH3），14.8（C-11）。以上數據與文獻［21］中一致，故鑒定為芥子酸乙酯。

化合物 12 為白色粉末狀固體，ESI-MS m/z 419.17 ［M + H］+；1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ∶6.47 （4H，s，H-2，6，2'，6'），5.38 （2H，br s，4，4'-OH），4.62（2H，d，J = 3.6 Hz，H-7，7'），4.17（2H，m，H-9b，9b'），3.79（14H，s，H-9a，9a'，3，5，3'，5'-OCH3），2.98（2H，br s，H-8，8'）。13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ∶147.3（4C，C-3，5，3'，5'），134.5 （2C，C-4，4'），132.3（2C，C-1，1'），102.8（4C，C-2，6，2'，6'），86.3（2C，C-7，7'），72.0（2C，C-9，9'），56.6（4C，3，5，3'，5'-OCH3），54.5（2C，C-8，8'）。以上數據與文獻［22］中一致，故鑒定為丁香脂素。

3　討論

中藥紅花的主要成分為醌式查爾酮碳苷類化合物及其他黃酮類化合物。本實驗分離得到的 12 個化合物主要為甾體和苯丙素類。我們推測在上述離體培養條件下，紅花細胞中與醌式查爾酮碳苷類等化合物生物合成相關關鍵基因處于沉默狀態所導致。通過在培養基中加入黃酮類化合物生物合成的前體乙酸鈉、苯丙氨酸、酪氨酸，可以有效提高黃酮類目標化合物的產量［23］；在培養基中添加適度濃度的誘導子，如酵母提取物、真菌誘導子、茉莉酸甲酯等或進行轉錄因子調控［24］，激活相關沉默基因，增加基因的轉錄和表達，以促進紅花愈傷組織進行醌式查爾酮碳苷類等化合物的生物合成。

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【Abstract】

ObjectiveTo investigate the chemical constituents from callus cultures of Carthamus tinctorius L.

MethodsCallus clutures of Carthamus tinctorius L. were scaled up using solid MS medium. Column chromatography on silica gel，Sephadex LH-20 and semi-preparative HPLC were used to separate and purify the compounds. Their structures were identified by analysis of MS and NMR spectroscopic data.

ResultsTwelve compounds were isolated from the cell cultures of C. ti nctorius L.， including stigmast-5-ene-3β-7β-diol，stigmast-5-ene-3β-7α-diol， stigmast-5，22-diene-3β-7β-diol， stigmast-5-ene-3β-7α-diol， hexadecanoic acid glyceride， methyl syringate，3，5-dimethoxy-P-hydroxybenzadehyde， P-hydroxybenzaldehyde， P-hydroxybenzoic acid， N-trans-feruloyl-tyramine， ethyl sinapate and syringaresinol.

ConclusionCompound stigmast-5-ene-3β-7β-diol， stigmast-5-ene-3β-7α-diol， stigmast-5，22-diene-3β-7β-diol， stigmast-5-ene-3β-7α-diol， methyl syringate， 3，5-dimethoxy-P-hydroxybenzadehyde， N-trans-feruloyl-tyramine and ethyl sinapate were isolated from this plant for the first time.

Author Affiliations： State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines， Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100050， China （TAN Zhen， CHEN Ri-dao， XIE Ke-bo， DAI Jun-gui）； College of Life and Environmental Sciences， Minzu University of China， Beijing 100081， China （YANG Lin）

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol， 2016， 11（4）：319-323

Chemical constituents from callus cultures of Carthamus tinctorius L.

TAN Zhen， CHEN Ri-dao， XIE Ke-bo， YANG Lin， DAI Jun-gui

Carthamus tinctorius；Cell culture techniques；Chemical constituents

DAI Jun-gui， Email： jgdai@imm.ac.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.04.006

國家自然科學基金（81573317）；中央級公益性科研院所基本科研業務費（2016CX14）

100050 北京，中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所（譚圳、陳日道、解可波、戴均貴）；100081 北京，中央民族大學生命與環境科學學院（楊林）

戴均貴，Email：jgdai@imm.ac.cn

2016-02-05