大鼠骨骼肌缺血再灌注致肺損傷的實驗研究

張彥榮，朱恬儀，武志峰，畢偉

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大鼠骨骼肌缺血再灌注致肺損傷的實驗研究

張彥榮，朱恬儀，武志峰，畢偉

作者單位： 050000石家莊，河北醫科大學第二醫院血管外科(張彥榮、武志峰、畢偉)； 河北醫科大學第三醫院神經

近年來，下肢缺血性疾病在臨床上很常見，其原因可以是房顫所致的肢體動脈栓塞，亦可以為動脈硬化基礎上的血栓形成，造成下肢缺血，經過治療后的再灌注損傷是目前臨床尤為重視的病理生理變化過程。再灌住損傷不僅可以導致局部組織第2次打擊，還能導致遠離器官(如腎、肺等)的繼發性損傷[1]，針對骨骼肌缺血再灌注損傷發病機制的研究，有助于了解此類疾病的發生、發展、治療及預后。

1材料與方法

1.1材料(1)實驗動物：健康清潔級Wistar大鼠24只，雄性, 4月齡，體質量200～250 g，由河北醫科大學實驗動物中心提供，飼養室通風良好，飼養溫度(22±2)℃，相對濕度65%～70%，光照周期12 h開/12 h關，所有大鼠飼養在干凈的塑料籠具里，飼料及食水均經滅菌處理[2]。(2)主要試劑和儀器設備： 20%烏拉坦(曹楊第二中學化工廠生產)，LDH、MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所生產)，蘇木素染液及伊紅染液(臺灣BASO貝索企業生產)。美國全自動生化分析儀CI8200，日本顯微鏡BHS(Olympus)，日本病理切片機Olympus CH20。

1.2動物分組及模型制備20%烏拉坦 (5 ml/kg)大鼠腹腔注射麻醉, 止血帶捆扎大鼠后肢根部,使兩后肢缺血, 依據缺血時間去除止血帶實現再灌注[3]。大鼠后肢腫脹、青紫，但無發黑破潰，大鼠呼吸心跳存在視為模型成功。24只大鼠隨機分為4組，每組6只。I組為對照組,僅進行常規麻醉，不阻斷后肢血流(14 h后取材); II組阻斷后肢動脈2 h，再灌注6 h;III組阻斷后肢動脈4 h再灌注6 h; IV組阻斷后肢動脈8 h再灌注6 h。

1.3觀測指標

1.3.1乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)檢測： 各組大鼠實驗畢經心臟穿刺取血5 ml，4℃下以3 500 r/min速度離心，取血清1 ml,-20℃保存待測；同時各組大鼠取肺組織5 g,生理鹽水沖洗，制成勻漿，在4℃下以3 500 r/min速度離心，取上清液1 ml,-20℃保存待測；血清LDH含量用比色法檢測、肺組織MDA含量用硫代巴比妥酸法檢測，嚴格按試劑盒說明書操作。

1.3.2骨骼肌、肺組織損傷情況： 各組大鼠實驗結束時，分別取左后肢內側肌肉組織及左肺下葉組織，以中性甲醛固定液固定24 h，梯度脫水9.5 h,透明1.5 h,浸蠟4 h，病理切片機切片,切片厚度4 μm，采用HE染色，顯微鏡下觀察組織學變化。

2結果

2.1大鼠一般情況實驗結束時，I組大鼠呼吸、心跳正常，后肢無腫脹，活動自如；II、III、IV組大鼠呼吸、心跳增快，其中II組大鼠后肢腫脹，顏色發紅，后肢活動不利； III、IV組大鼠后肢明顯腫脹伴不同程度的青紫，后肢不能直立。

2.2血清LDH、肺組織MDA含量LDH水平：與I組比較，II、III、IV組均升高(P<0.05)，其中IV組升高最為明顯(P<0.05)；肺組織MDA水平：與I組比較，II組差異無統計學意義，III、IV組MDA明顯升高,且與前2組比較有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1　血清LDH及肺組織MDA含量比較　

注：與I組比較，aP<0.05；與II組比較，bP<0.05；與III組比較，cP<0.05

2.3骨骼肌及肺組織變化(1)骨骼肌： I組骨骼肌細胞正常,大小均勻，排列整齊，呈多邊形，粉紅染；結締組織呈淺粉色，較肌細胞染色淡；II組骨骼肌細胞水腫明顯，血管擴張充血，少量炎細胞浸潤；III組骨骼肌細胞充血、水腫明顯，少量壞死灶存在，大量炎細胞浸潤；IV組肌細胞大片壞死，結構破壞，染色淺淡，大量炎細胞浸潤(圖1見封3)。(2)肺組織： I組肺泡上皮細胞正常，肺泡及肺泡間隔組織結構正常,呈網狀疏松結構，肺泡間隔無充血及水腫，肺泡腔內無滲出物及炎細胞浸潤等改變；II組正常肺泡上皮細胞，僅少量炎細胞浸潤,III組肺泡擴張融合，間隔增寬，充血，大量炎細胞浸潤；IV組肺泡大小不等，間隔明顯增寬變形，結構破壞，間質大量炎細胞浸潤(圖2見封3)。

3討論

缺血再灌注的概念是McCord于1985年首次提出的，它是指機體組織在急性缺血一段時間后，對組織代謝、結構和功能造成的損傷并沒有隨著血流的恢復而恢復，而是不斷加重，甚至出現了不可逆的損傷乃至壞死的狀態[4]。當組織缺血時間達到6～8 h后即可出現組織細胞壞死，再灌注后不僅可造成缺血組織進一步損傷，亦可造成遠隔臟器損傷，嚴重者危及生命。正常骨骼肌細胞內含豐富的乳酸脫氫酶(LDH)，由于骨骼肌細胞受到損傷，其細胞膜結構破壞，通透性增高，使得LDH釋放入血。目前對于缺血再灌注損傷機制的研究還不十分清楚，對于乳酸脫氫酶升高，認為主要是由于氧自由基的堆積及鈣超載2大因素引起的[5]，研究顯示肌細胞缺血，氧供減少，氧自由基清除系統功能障礙，生成系統潛在活性升高，一旦恢復血供，氧自由基爆發式產生，從而造成組織細胞損傷，膜流動性和鈣離子通透性升高，細胞膜結構完整性被破壞；鈣超載可激活細胞膜磷脂酶和蛋白酶，質膜損害，導致LDH大量外流入血[6，7]，組織損傷程度越重，釋放入血的LDH越多。因而血清中乳酸脫氫酶的含量可作為衡量骨骼肌細胞損傷的敏感指標，其含量的高低可反映骨骼肌細胞損傷的程度。本結果顯示隨著缺血時間的延長,LDH逐漸升高,說明骨骼肌損傷逐漸加重，這一點在不同組別骨骼肌HE染色中亦可顯示。

骨骼肌缺血再灌注肺損傷時可產生大量的過氧化物和超氧自由基。氧自由基是指含有氧而且不成對電子位于氧原子上的自由基。其特性是極不穩定，半衰期短，能奪取電子而使其他細胞結構敏感分子氧化，對機體造成持續性的損害[8，9]。氧自由基對組織的損傷主要通過脂質過氧化作用來完成[10，11]，細胞膜磷脂中的多不飽和脂肪酸被氧自由基所氧化，細胞膜完整性遭到破壞，其通透性明顯增加[12]；而且脂質過氧化一旦被引發，則可呈連鎖反應，呈擴散和放大趨勢[13]；同時氧自由基還通過激活核因子-κB信號轉導通路,造成細胞因子、黏附分子及炎性反應的酶類過度表達[14]，這些物質直接或間接地參與了缺血再灌注損傷[15]。丙二醛(MDA)是自由基與細胞膜脂質過氧化反應的產物，其含量多少可以反映脂質過氧化程度并間接反映自由基的多少，MDA越高，說明氧自由基對組織損傷越重。因此MDA是判斷脂質過氧化的可靠指標[16，17]，本實驗中，I組、II組MDA無明顯升高，說明該條件下缺血再灌注對肺損傷不明顯，而III、IV組MDA依次升高,說明肺損傷隨缺血時間的延長依次加重。這一點從肺組織HE染色中亦可得到證實。在III組肺組織已出現組織學改變，而且在IV組，骨骼肌細胞大片壞死，同時肺損傷嚴重，肺泡間隔明顯增寬，結構破壞。因此，在骨骼肌缺血再灌注后組織細胞損傷依缺血時間的延長而加重，一定程度的缺血再灌注可致肺損傷。

隨著生活水平的提高，下肢缺血的疾病日益增多，因此本研究將有助于肢體缺血再灌注損傷機制的研究，以便更好地服務于臨床。

參考文獻

1王艷蕾,崔國金,蔡慶艷,等.參麥注射液對腸缺血再灌注肺脂質過氧化損傷的影響[J].天津醫藥,2010,38(11):986-989.

2黃春榮.SPF級動物實驗室凈化空調系統運行管理和保養[J].機電信息,2012,(32):56-57.

3張連元,楊林.生理科學實驗教程[M].北京:人民軍醫出版社,2001:29-30.

4Skyschally A,Schulz R,Heusch G.Pathophysiology of myocardial infarction: protection by ischemic pre- and postconditioning[J].Herz,2008,33(2):88-100.

5呂春陽,陳志勇,王浩.血清 C-反應蛋白與乳酸脫氫酶評價急性胰腺炎預后的臨床研究[J].中華醫院感染學雜志,2014,24(23):5809-5811.

6趙瑞芳.熊果酸對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用[J].中國醫藥導報,2015,2(7):24-28, 169.

7韓帥先,姚煥玲,李云云,等.菟絲子提取物對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護作用[J].中國藥理學通報,2011,27(4):533-536.

8劉煜敏,徐仁伵,黃懷鈞,等.興奮性氨基酸、氧自由基與缺血再灌注腦損傷關系的實驗觀察[J].卒中與神經疾病,2000,7(2):98-100.

9楊蓉,常亮,劉金明,等.羅格列酮對高糖刺激下新生大鼠心臟成纖維細胞Ⅰ型前膠原表達的調節[J].中國醫藥導報,2013,10(21):9-12.

10鄧文騫.間歇性高壓氧處理對大鼠骨骼肌挫傷修復及SOD、MDA和GSH-px的影響[J].中國康復醫學雜志,2015,30(2):160-164.

11Attwell D,Mcardle A,Griffiths RD,et al.Measurement of free radical production by in vivo microdialysis during ischemia/reperfusion injury to skeletal muscle[J].Free Radic Biol Med,2001,30(9):979-985.

12張麗娜,安中平.丁苯酞注射液對急性缺血性腦卒中患者認知功能的影響[J].山東醫藥,2015,55(4):51-52.

13胡哲夫,唐其柱,劉源,等.橙皮素對轉化生長因子-β1誘導心肌成纖維細胞增殖的影響[J].疑難病雜志,2015,14(4):376-379.

14雷素英,李銀生,周剛,等.姜黃素對肺纖維化大鼠肺組織NF-κB和IκBα表達的影響[J].疑難病雜志,2010,9(11):828-830.

15Shih HC,Huang MS,Lee CH.Magnolol attenuates the lung injury in hypertonic saline treatment from mesenteric ischemia reperfusion through diminishing iNOS[J].Journal of Surgical Research,2012,175(2):305-311.

16邵壯,熊江,郭偉,等.烏司他丁對大鼠肢體缺血再灌注損傷的保護作用及其機制[J].臨床和實驗醫學雜志,2014,13(10):777-781.

17Gokalp O,Yurekli I,Kiray M,et al.Assessment of protective effects of pheniramine maleate on reperfusion injury in lung after distant organ ischemia: a rat model[J].Vasc Endovascular Surg,2013,47(3):219-224.

《疑難病雜志》述評欄目征稿

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論著·基礎

肌肉病科(朱恬儀)

【摘要】目的觀察大鼠骨骼肌不同缺血時間再灌注造成肺損傷的變化。方法將雄性Wistar大鼠24只隨機分為4組，I組為對照組,僅進行常規麻醉，不阻斷后肢血流; II組為阻斷后肢血流2 h再灌注6 h；III組為阻斷后肢血流4 h后再灌注6 h; IV組為缺血8 h后繼續再灌注6 h; 檢測大鼠血清乳酸脫氫酶(LDH)、肺組織丙二醛(MDA)含量、肌肉組織及肺組織的病理變化。結果(1)LDH水平:實驗后，I組變化不明顯,II、III、IV組呈上升趨勢，與I組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，且IV組>III組>II組(P<0.05)。(2)MDA水平:實驗后，I、II組變化不明顯，III、IV組呈上升趨勢，且IV組>III組>II、I組(P<0.05)。(3)肌肉組織光鏡結果隨缺血時間的延長損傷依次加重，IV組骨骼肌組織細胞大片壞死。而肺組織損傷僅見在III、IV組，且程度逐漸加重。結論大鼠骨骼肌缺血再灌注后組織細胞損傷依缺血時間的延長而加重，缺血4 h再灌注6 h時可繼發肺損傷。

【關鍵詞】骨骼肌; 缺血再灌注損傷; 肺損傷；乳酸脫氫酶；丙二醛；大鼠

Experimental study of skeletal muscle ischemia reperfusion induced lung injury in ratsZHANGYanrong*,ZHUTianyi，WUZhifeng,BIWei.*DepartmentofVascularSurgery,theSecondHospitalAffiliatedtoHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the changes of lung injury caused by different ischemia time of skeletal muscle.MethodsTwenty-four male Wistar rats were randomly assigned for four groups, group I as the control group, only general anesthesia, did not block the hind limb blood flow; group II for blocking hind limb blood flow for 2 h and reperfusion for 6 h; group III for blocking hind limb blood flow 4 h and reperfusion 6 h; group IV for ischemia 8h and 6 h of reperfusion; detected rat’s serum lactate dehydrogenase (LDH) and malondialdehyde (MDA) content, muscle tissue and lung tissue pathological changes.Results(1) LDH levels: after the experiment, changes in group I is not obvious, group II, III and IV showed a rising trend, the difference were significant compared with group I(P<0.05), and the group IV > group III >group II (P<0.05). (2) The level of MDA: after the experiment, group I and group II changes were not obvious, and group III and IV showed a rising trend, and group IV > group III > group II and I (P<0.05). (3) The microscopic findings of the muscle tissue were increased with the increase of ischemia time, and the damage of the IV group was severe. But lung tissue injury only found in group III and IV, and gradually increased the level of blocking time.ConclusionRat skeletal muscle ischemia and after reperfusion tissue damage in accordance with the prolongation of ischemia time and aggravating, ischemia for 4 h and reperfusion 6 h can occurred with lung injury.

【Keywords】Skeletal muscle; Ischemia reperfusion injury; Lung injury; Lactate dehydrogenase; Malondialdehyde;Rats

收稿日期：(2015-05-28)

【DOI】10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.12.021

基金項目：河北省科學技術支撐項目(No.132777147)