DNA分子鑒定技術在中成藥真偽性鑒別中的應用與研究進展

陳蓉，吳成麗，鄧赟，卞金輝

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DNA分子鑒定技術在中成藥真偽性鑒別中的應用與研究進展

陳蓉1，吳成麗1，鄧赟2，卞金輝2

［摘要］中成藥真偽性的準確鑒定是臨床用藥安全有效的前提所在，DNA分子鑒定技術是分子生物學上的一種常規技術，應用于中成藥真偽性的鑒別是對目前中藥質量控制體系的有效補充。本文主要從中成藥DNA分子鑒定常規操作流程及DNA分子鑒定在中成藥的真偽性鑒別中的應用研究方面進行了綜述，并對其應用過程中存在的問題和發展前景進行了總結和展望。

［關鍵詞］DNA分子鑒定；中成藥；綜述

［作者單位］1.成都中醫藥大學民族醫藥學院，四川 成都 611137；2.成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137

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DNA分子鑒定技術是指利用分子生物學技術對某物種或某個體中特異性的DNA序列進行分析鑒定，從而達到在分子水平上對物種和個體進行鑒定的目的，它作為近代科學技術發展的重要成果已經被廣泛的應用到各物種的分類鑒定中來［1-3］。上個世紀90年代以來，不斷有學者把DNA分子鑒定技術應用到中藥的鑒定中來［4-7］，2010版藥典及其增補本相繼收錄了烏梢蛇、蘄蛇的聚合酶鏈式反應（PCR）鑒別法、川貝母的聚合酶鏈式反應-限制性內切酶長度多態性鑒別方法（PCR-RFLP），2015版藥典還建立了《中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導原則》。由此可見，DNA分子鑒定技術有望成為繼化學儀器分析技術應用于中藥質量評價之后又一應用于中藥質量控制的常規技術。

但是目前納入標準的中藥DNA分子鑒定技術主要集中在對中藥材的鑒定上，對于中成藥的DNA分子鑒定還未見收錄。由于中成藥的組成復雜，其質量控制難度更大，中成藥中的造假、摻假現象也更為嚴重，而DNA分子鑒定技術具有快速、微量、特異性強等特點，能夠對中成藥中原料藥材進行快速、準確鑒定，所以建立中成藥的DNA分子鑒定方法對解決目前中成藥質量控制中的一些難題顯得非常迫切和必要。

本文搜集了近年來中成藥DNA分子鑒定中的代表性研究成果，主要從中成藥DNA分子鑒定常規操作流程及DNA分子鑒定在中成藥真偽性鑒別中的應用研究方面進行綜述和總結，并對其目前應用中存在的問題及發展前景進行了展望。

1　DNA分子鑒定技術鑒別中成藥真偽性的一般流程

1.1 中成藥中基因組DNA的提取

目前常用的基因組DNA提取方法包括CTAB法、SDS法、離心柱型試劑盒法、磁珠試劑盒法等。羅［8］等人以麥冬為例，對上述常用DNA提取方法在中藥中的應用進行了比較研究，研究發現改良CTAB法提取出的DNA質量和數量為最優，陳玉秀［9］、杜向紅［10］、劉麗華［11］、劉楊［12］等也針對不同的藥材，分別對CTAB法進行改進，提高了中藥玉竹、蒲公英、景天三七、吳茱萸等藥材中DNA的提取效率；但是陳莉等［13］在利用CTAB法和SDS法對丹參、絞股藍、三七進行DNA提取的研究中發現，丹參、絞股藍的DNA適用于CTAB法提取，而三七的DNA更適合用SDS法提取，其原因是不同植物中含有不同的次生代謝產物，這些次生代謝產物會不同程度的影響DNA的提取。Chen R［14］等也發現對于不同劑型的中成藥也需要根據樣品特征選取不同的DNA提取方法，比如固體制劑可選用改良的CTAB法，而液體制劑則需要采用乙醇重結晶或者是柱吸附試劑盒進行富集提取。由此可見，對于中成藥的DNA提取，目前還沒有通用的方法，需要根據待檢測中成藥中不同的藥材以及不同的制劑類型設計優化相關的DNA提取方法。

1.2 中成藥中目的DNA的擴增

對于中成藥中目的DNA的擴增，按照所用引物分類可分為通用引物PCR法以及特異性引物PCR法。通用引物對于植物一般采用ITS2或者psbA-trnH區域通用引物，對于動物一般采用COI序列通用引物進行擴增［15］。特異性引物PCR則需要根據不同的檢測對象選擇其特異性DNA序列，并設計特異性引物對其進行擴增［16， 17］，這兩類方法各有優缺點，通用引物PCR法無需設計特異性引物，在PCR方案設計當中相對簡單，但是對于擴增產物的檢測則需要依靠DNA測序儀等；特異性引物PCR法前期建立方法時需要對待檢測品種及其混偽品進行序列比對，并設計特異性引物，但是在后期PCR產物檢測中則依靠常規的瓊脂糖凝膠電泳等手段即可快速獲得檢測結果，利于此類檢測方法的推廣。

此外，目前已報道的中成藥的DNA分子鑒定中目標序列的擴增，按照操作流程則可分為普通PCR和巢式PCR，巢式PCR是在普通PCR之前，利用通用引物或者特異性引物對待檢測樣品再進行一次PCR操作，可以達到富集DNA和提高特異性的目的，適用于對復雜樣本組［18］或者極其微量DNA的擴增［14］。

1.3 中成藥中目的DNA擴增產物的檢測

在分子生物學技術中，對于PCR擴增產物的檢測有較多方法：經典的瓊脂糖凝膠電泳檢測技術，新進發展起來的第一代、第二代高通量測序技術，可以定量的熒光定量PCR技術，以及納米金、比色探針等可視化檢測技術。對于中成藥目的DNA擴增產物的檢測，可以根據具體需要選用適當的PCR擴增產物檢測方法，目前已報道的有：玉屏風散中白術、黃芪、防風等藥材的鑒定采用瓊脂糖凝膠電泳檢測［19］；連翹敗毒丸中金銀花的鑒定采用第一代測序法檢測［20］，八寶清心散等中成藥中原藥材的鑒定采用第二代高通量測序法［21］；生脈飲、烏雞白鳳丸等中成藥中人參藥材的檢測采用G-四聚體比色探針法等［14］。

2　DNA分子鑒定技術在中成藥真偽性鑒別中的應用

中成藥不同于中藥材在于，中藥材為單一動物或者植物樣本，而中成藥除少數是單味藥組成外其余均為多種藥材混合加工而成，并有多種制劑方式，其基因組DNA較為復雜，對其進行檢測也更加困難。此外，在制劑工藝中，中成藥中的藥材，有的經過研磨粉碎直接入藥，有的經過煎煮提取以提取液形式入藥，有的在提取過程中還加入了乙醇進行沉淀等，這些加工都在不同程度上都降低了藥材DNA的質量和數量。同時，多種藥用輔料的加入，如蜂蜜、淀粉、糖包衣等對DNA的提取也造成了極大的困難，所以根據劑型不同以及中成藥的具體制劑工藝不同，對其中藥材DNA的鑒定方案也有所不同。

2.1 以原藥材直接入藥的中成藥

2.1.1 單味藥材組成的中成藥或保健品 目前市售的部分中成藥或者保健品是由單味藥材組成，這種藥品大多是一些貴重中藥，具有較高的經濟價值，其摻假現象也比較嚴重，建立這類藥品的DNA分子鑒定方法能準確的判斷該藥品的真偽性，因此有較大的應用價值。同時，僅含有單味藥材的中成藥其成分也相對單一，DNA提取和鑒定均可采用中藥材DNA鑒定所用的方法，難度較低。

Mihalov JJ［22］等人利用DNA測序技術對植物的ITS序列進行測序，成功地鑒別了西方市場上混淆流通的人參和西洋參的粉末制品、片劑和膠囊劑等。王巍［23］等人利用特異性引物PCR技術對全天麻膠囊中的天麻及常見偽品進行了鑒定，不僅建立了天麻的特異性引物PCR鑒定法，還成功的從某廠家的全天麻膠囊中檢測出天麻常見偽品馬鈴薯的DNA。劉光全［24］等人利用ITS序列分析技術對3個不同廠家的蟲草膠囊進行了分析，結果發現有2個廠家所用樣品為西藏蟲草和蛹蟲草，均與其產品名稱“冬蟲夏草”

不相符合，也不屬于國家衛計委允許的保健食品菌株。目前冬蟲夏草的藥典標準僅規定腺苷的含量不低于0.010%，腺苷是一種非特異性化合物，廣泛存在于各種動植物藥中，上述西藏蟲草和蛹蟲草中也存在較高含量的腺苷，所以腺苷的測定不能有效的控制冬蟲夏草及其成藥或者保健品的質量，而通過DNA分子鑒定則能直接有效地鑒別出其真偽性。

2.1.2 多味藥材組成的中成藥 對于一些由多味中藥材配伍而成的中成藥的DNA分子鑒定，目前也有相關報道。Coghlan， M. L［21］等人利用第二代高通量測序技術對澳大利亞海關扣留的包括粉劑、片劑、膠囊劑等在內的15種中藥樣品進行測序分析，鑒定出了68種動植物品種，發現了瀕危物種亞洲黑熊和高鼻羚的DNA，這不僅為中藥質量控制提供了新技術，也為藥品監管、非法貿易的查處提供了技術支持。但是就目前而言，第二代高通量測序技術相對來說普及面較窄，價格較高，序列分析技術壁壘較高，更多應用于醫學檢測，在中成藥真偽性鑒別中的應用前景還比較有限。崔占虎［18］等利用特異性引物PCR技術結合DNA測序對包括連翹敗毒丸、牛黃清宮丸、健腦補腎丸、金噪開音丸等在內的6種含有金銀花藥材的中成藥進行了分析，在6種樣品中均成功檢測出了金銀花的特異性DNA序列。但是該法采用了巢式PCR操作，首先利用通用引物對trnL-trnF葉綠體序列進行擴增富集，再將PCR產物稀釋后，用金銀花特異性引物進行第二輪PCR，最后將擴增產物經克隆測序得分析結果。巢式PCR的引入使操作更加繁瑣，也提高了PCR污染的幾率。同時通過克隆測序對檢測結果進行分析雖然使檢測結果更加直觀可靠，但是也進一步延長了檢測周期，提高了檢測成本，所以該方法在技術上還需要進一步改進。此外， Cheng KT［25］等首次利用隨機擴增多態性（RAPD）技術對著名中成藥“玉屏風散”中的白術、黃芪、防風等藥材進行了鑒別研究；隨后，李會軍［26］等人同樣利用該技術，建立了中成藥中川貝母的DNA標準圖譜，利用待測樣品的DNA圖譜與標準圖譜相比較，從而判斷待檢測中成藥的真偽性；崔占虎［20］等利用psbA-trnH和rbcL兩個葉綠體通用引物對中成藥連翹敗毒丸中植物藥材的DNA進行擴增，再將擴增產物進行分子克隆，通過挑取單克隆測序的方法鑒定出了連翹敗毒丸中6種原料藥材；Chen R［14］等人采用特異性引物PCR技術對含有人參的中成藥進行分析，在其片劑、丸劑等劑型中均成功擴增出人參的特異性DNA條帶，這些都是DNA分子鑒定技術對多味藥材組成的中成藥鑒別的有益嘗試。

2.2 以提取液入藥的中成藥

中成藥的一些新劑型中有些中藥材是以提取液入藥的，如復方丹參滴丸中的三七、地奧心血康膠囊中的薯蕷以及各種口服液、注射液中的各類藥材等，而現代提取工藝中主要用水提法、醇提法等，由于DNA不溶于乙醇，所以對經過乙醇提取以及經過乙醇沉淀的提取液，其中大部分DNA會被除去，僅留下極少量的DNA，這大大提高了此類中成藥中中藥材DNA提取和鑒定的難度，即使對水提取液入藥的中成藥，其DNA富集和鑒定的難度也較大，目前這方面的相關報道也較少。Chen R［14］等人曾利用巢式PCR技術檢測出了藿香正氣水中的半夏以及常見偽品虎掌半夏、水半夏，直接有效的解決了藿香正氣水中半夏摻假鑒定的難題。由此可見，對于部分以提取液入藥的中成藥中微量的DNA也可以通過擴增后檢測。該文章還建立了含有人參和黨參口服液以及注射液中對應藥材的檢測方法，并以比色探針為基礎開發了可視化檢測芯片技術代替傳統的瓊脂糖凝膠電泳檢測，提高了檢測效率，并使檢測結果更加直觀、可靠。

3　展望

綜上，隨著2015版藥典《中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導原則》的建立，將會有越來越多的中藥材DNA分子鑒定方法被收入藥典，同時也會有越來越多的研究聚焦到中成藥的DNA分子鑒定上來，利用其解決中成藥質量控制中真偽鑒別等的一些難題，有效彌補現有分析方法的不足。但中成藥的DNA分子鑒定技術還存在一些亟待解決的問題，首先由于中成藥本身組成復雜、品種繁多、制劑不同、輔料添加等原因存在，增加了中成藥DNA分子鑒定的難度；其次，中成藥DNA分子鑒定是從分子角度對中成藥中所用藥材的“真偽”進行鑒別，對于藥品的質量尚無法進行判斷；第三，對于利用正品藥材非藥用部位的摻假等也并不能鑒別。所以，我們要正確認識和利用DNA分子鑒定技術的優勢，建立和完善相應中成藥的質量控制、評價標準，從而不斷推進中藥現代化的進程。

［參考文獻］

［1］N. Hebert P. D.， A. Cywinska， L. Ball S.， et al.Biological identifications through DNA barcodes［J］.Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences，2003，270（1512）:313.

［2］Natonek-Wisniewska Malgorzata， Krzyscin Piotr，Piestrzynska-Kajtoch Agata.The species identification of bovine， porcine， ovine and chicken components in animal meals， feeds and their ingredients， based on COX I analysis and ribosomal DNA sequences［J］.Food Control，2013，34（1）:69.

［3］Ni Ping-Ya， Pei Li， Ge Wen-Dong， et al.Applications of DNA identification technology in protection of wild animals［J］.Fa yi xue za zhi，2011，27（6）:451.

［4］Cui X. M.， Lo C. K.， Yip K. L.， et al.Authentication of Panax notoginseng by 5S-rRNA spacer domain and random amplified polymorphic DNA （RAPD） analysis［J］.Planta Medica，2003，69（6）:584.

［5］Lum M. R.， Potter E.， Dang T.， et al.Identification of botanicals and potential contaminants through RFLP and sequencing［J］. Planta Medica，2005，71（9）:841.

［6］Chen S. L.， Yao H.， Han J. P.， et al.Validation of the ITS2 Region as a Novel DNA Barcode for Identifying Medicinal Plant Species［J］.Plos One，2010，5（1）.

［7］Lei W.， Li S. S.， Peng Q. Y.， et al.A Real-Time qPCR Assay to Quantify Ophiocordyceps sinensis Biomass in Thitarodes Larvae［J］.Journal of Microbiology，2013，51（2）:229.

［8］羅焜， 馬培， 姚輝，等.中藥DNA條形碼鑒定中的DNA提取方法研究［J］.世界科學技術（中醫藥現代化），2012，14（02）:1433.

［9］陳玉秀， 周日寶， 潘清平，等.玉竹基因組DNA的提取與分析［J］.西北藥學雜志，2007，22（04）:171.

［10］杜向紅， 杜云鋒， 李喜鳳.中藥蒲公英基因組總DNA提取方法研究［J］.中華實用診斷與治療雜志，2012，26（01）:15.

［11］劉麗華， 杜建梅， 馮寶珍.中藥材景天三七DNA提取方法的比較分析［J］.江蘇農業科學，2014，42（12）:47.

［12］劉楊， 黃海， 陶建蜀，等.用改良CTAB法從吳茱萸不同組織提取基因組DNA［J］.貴陽醫學院學報，2009，34（01）:101.

［13］陳莉， 魏莉， 周童，等.幾種中藥DNA提取方法的比較研究［J］.廣西植物，2007，27（01）:137.

［14］Chen Rong， Dong Juan， Cui Xin， et al.DNA based identification of medicinal materials in Chinese patent medicines［J］.Sci. Rep.，2012，2

［15］辛天怡， 雷美艷， 宋經元.中藥材DNA條形碼鑒定研究進展［J］.中國現代中藥，2015，17（02）:170.

［16］Jigden B.， Wang H.， Kim M. K.， et al.Authentication of the Oriental Medicinal Plant Ligusticum tenuissimum （Nakai）Kitagawa （Korean Go-Bon） by Multiplex PCR［J］.Planta Medica，2010，76（6）:648.

［17］Wang Hongtao， Kim Min-Kyeoung， Kwon Woo-Saeng， et al.Molecular authentication of Panax ginseng and ginseng products using robust SNP markers in ribosomal external transcribed spacer region［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2011，55（5）:972.

［18］崔占虎， 蔣超， 袁媛，等.6種成藥中原料藥材金銀花的分子鑒別研究［J］.包頭醫學院學報，2014，30（01）:1.

［19］Cheng K. T.， Su C. H.， Chang H. C.， et al.Differentiation of genuines and counterfeits of Cordyceps species using random amplified polymorphic DNA［J］.Planta Medica，1998，64（5）:451.

［20］崔占虎， 蔣超， 李旻輝，等.連翹敗毒丸中原料藥材的分子鑒別［J］.藥學學報，2013，48（04）:590.

［21］Coghlan M. L.， Haile J.， Houston J.， et al.Deep sequencing of plant and animal DNA contained within traditional Chinese medicines reveals legality issues and health safety concerns［J］.PLoS Genet，2012，8（4）:e1002657.

［22］Mihalov J. J.， Marderosian A. D.， Pierce J. C.DNA identification of commercial ginseng samples［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000，48（8）:3744.

［23］王巍， 鄧赟， 戴宇，等.全天麻膠囊中天麻的DNA鑒定［J］.中藥與臨床，2015，6（1）:38.

［24］劉光全， 陶水華， 李輝， 等.蟲草膠囊菌粉的鑒定與分析［J］.中國食品衛生雜志，2009，21（05）:418.

［25］KT Cheng， HS Tsay， CF Chen， et al.Determination of the components in a Chinese prescription， yu-ping-feng san， by RAPD analysis［J］.Planta Medica，1998，64（6）:563.

［26］李會軍， 李萍， 徐傳林.一種含貝母的中成藥中川貝母的分子生物學鑒定方法:中國專利.201010155946.7［P］，2010-04-27.

（責任編輯：胡慧玲）

DNA identification of Chinese patent medicines: A review

CHEN Rong1， WU Cheng-li2， DENG Yun2， BIAN Jin-hui2// （1.

School of Ethnomedicine， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， Sichuan； 2. School of Pharmacy，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， Sichuan）

［Key words］DNA identification； Chinese patent medicines； review

［Abstract］To ensure clinical safety and efficacy， it is very important that the Chinese Patent Medicines （CPMs） are accurately identified. DNA identification which is conventionally used in molecular biology can be an effective supplementary of CPMs’quality control. This article reviews the general protocol of CPMs’ DNA identification and its application in the quality evaluation of Traditional Chinese Medicines. Additionally， the current problems and future development of CPMs’ DNA identification are also prospected at the end.

［中圖分類號］R 284.1

［文獻標識碼］A

［文章編號］1674-926X（2016）02-026-04

［基金項目］四 川省教育廳理工科一般項目（14ZB0077）；成都中醫藥大學科技發展基金（ZRQN1434）；四川省科技廳項目（2014SZ0071-4）

［作者簡介］陳 蓉（1987-），女，碩士，助教，主要從事中藥DNA分子鑒定研究

［通訊作者］卞 金輝（1975-），男，副教授，主要從事中藥藥效物質基礎及質量標準研究

［收稿日期］2015-09-12