維生素C對紫外線誘導的光老化大鼠皮膚結構的影響

樓彩霞，高　擎，孫　俠，黃　威，鐘志勇，鄺少松，葛亞中

(1.廣東省醫學實驗動物中心比較醫學實驗室，佛山，廣東　528248；2.無限極(中國)有限公司，廣州，廣東　510000)

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維生素C對紫外線誘導的光老化大鼠皮膚結構的影響

樓彩霞1，高擎2，孫俠1，黃威1，鐘志勇1，鄺少松1，葛亞中2

(1.廣東省醫學實驗動物中心比較醫學實驗室，佛山，廣東528248；2.無限極(中國)有限公司，廣州，廣東510000)

【摘要】目的研究維生素C對光老化大鼠皮膚結構的保護作用，為臨床用藥和保健提供依據。方法用紫外線輻射背部皮膚的方法建立光老化大鼠模型，每周照射2次，連續4周，UVA累計輻射量為123 J/cm2，UVB累計輻射量為5 J/cm2。造模期間，大鼠每天灌胃給予維生素C溶液50 mg/kg，持續30 d。實驗結束后，比較模型組和治療組照射部位皮膚在大體形態、光鏡和透射電鏡下的組織結構差異。結果與模型組相比，維生素C組以下方面的皮膚結構損傷程度得到減輕：紅疹、潰瘍、表皮細胞增生、表皮增厚、真皮血管擴張、炎細胞浸潤、成纖維細胞增生、內質網擴張、線粒體腫脹和空泡化、彈力纖維變性和局灶性蓄積、膠原纖維橫斷面粗細不均。結論大鼠皮膚光老化模型建立成功。維生素C對紫外線誘導的光老化皮膚結構損傷有明顯的保護作用。 論文包括中文題目、作者、單位(單位所在地和郵編)、中文以及英文題目、作者、單位與 3．和 中文應包括目的、方法、結果(應有主要數據)、結論四部分內容。篇幅一般300字左右。 、中文 不分段。英文 應有英文題目、作者、作者單位、郵政編碼、正文和 正文的內容與中文 基本相同，可更為詳細些，但不宜過長。英文 置于中文 下方。

【關鍵詞】維生素C；抗光老化；皮膚結構；模型，大鼠 是反映文章最主要內容的術語。中英文的意思要相同。 之間用分號隔開。 (3～8個)、 (與中文 。英文 對應)、正文、

皮膚細胞經常暴露于外源性和內源性來源的活性氧(ROS)和氧化應激中，由于紫外線可以增強細胞活性氧的產生，使得皮膚老化通常與紫外線輻射密切相關[1]。紫外線輻射是致皮膚老化或皮膚癌發展最重要的環境因素，通過降低暴露于紫外線的輻射水平或增加抗氧化防御有效地清除活性氧能夠減少皮膚的老化損傷[2]。可以保護我們皮膚的內源性物質是黑色素和酶的抗氧化劑，補充抗氧化劑可以對紫外線輻射起到保護作用[1]。日常生活中引起皮膚光老化的紫外線，主要是長波UVA和中波UVB。UVA具有很強的穿透力，有超過98%能到達地球表面，可以直達肌膚的真皮層，破壞彈性纖維和膠原纖維；UVB具有中等穿透力，僅有不足2%能到達地球表面，對皮膚具有紅斑作用。維生素C常被作為化妝品添加物用于防治皮膚老化，抗氧化方面的指標研究得比較多，它作為抗氧化劑、酪氨酸酶抑制劑，可以誘導膠原合成，對皮膚皺紋、質地、強度和均勻度有修復的功效[3]，對人體皮膚癌細胞因紫外線輻射誘導的細胞凋亡有保護作用[4]。由于人體皮膚組織標本不易獲取，動物實驗在一定程度上可以彌補人體試驗的局限性。目前未見針對維生素C對光老化動物皮膚在電鏡和光鏡下結構影響的報道。本研究一方面通過大致模擬日光中UVA和UVB輻射比例參數，采用UVA+UVB紫外線輻射的方法建立光老化大鼠模型，為光老化動物模型研究提供背景數據和方法學參考；另一方面通過采用在大鼠造模期間灌胃給予維生素C的方法，研究模型組和維生素C組照射部位皮膚在大體形態、光鏡和透射電鏡下組織結構的差異。

1材料和方法

1.1實驗動物及實驗環境

SPF級SD大鼠，24只，雌性，體重(180～220) g，均購于廣東省醫學實驗動物中心〔SCXK(粵)2013-0002〕。本實驗所有動物實驗操作均在廣東省醫學實驗動物中心實驗設施內進行〔SYXK(粵)2013-0002〕。

1.2主要試劑

維生素C片(批號130803)，廣東華南藥業集團有限公司；石蠟、二甲苯、酒精、麗春紅，上海試劑三廠；伊紅、蘇木素，廣州市中南化學試劑有限公司；維多利亞藍B(批號1112067)，Aladdin Chemistry；中性樹膠，中國上海標本模型廠。

1.3主要儀器

紫外光療儀，天津市合普科技有限公司；BS224S天平，德國Sartorius公司；TS-12N全自動生物組織脫水機，湖北宏業醫用儀器有限公司；RM2135輪轉切片機，德國徠卡；RS-18II全自動生物組織染色機，湖北宏業醫用儀器有限公司；正置光顯微鏡，Olympus BX41；Image-Pro Expess 5.1.1.14病理圖像分析系統；Hitachi(日立)-7650透射電子顯微鏡。

1.4動物造模

將檢疫合格的24只SD大鼠隨機分為空白對照組、模型組和維生素C組，每組8只。空白對照組不進行任何處理；模型組每次照射前，在大鼠背部5 cm × 5 cm區域內剃毛，使皮膚充分暴露，將大鼠置于頭部避光、背部暴露的固定器中，放入紫外光療儀(UVA+UVB)燈具正下方的30 cm處照射，每周照射2次，連續照射4周，UVA累計輻射量為123 J/cm2，UVB累計輻射量為5 J/cm2；維生素C組參照模型組方法照射紫外線。本實驗所有動物實驗操作均經過廣東省醫學實驗動物中心實驗動物倫理委員會批準。

1.5維生素C干預

空白對照組不進行任何處理；模型組灌胃同體積溶媒，每周照射紫外線2次，連續照射4周；大鼠給予維生素C的劑量為每天50 mg/kg，連續灌胃30 d，期間每周照射紫外線2次。造模過程中，觀察大鼠照射部位皮膚的變化。

1.6組織學檢測

給藥30 d后，動物用3%戊巴比妥鈉麻醉，安樂處死，切取受試部位皮膚進行檢測。各組每只動物的受試部位皮膚同時分成兩份進行處理：一部分皮膚切成0.5 cm×0.5 cm大小，放置于4%多聚甲醛液固定，常規制作石蠟切片，分別進行蘇木精-伊紅染色法(H&E)、馬松三色法(Masson’s trichrome)、維多利亞藍B(Victoria blue B)染色；另一部分皮膚切成1 mm × 2 mm大小，放置于3.1%的4℃戊二醛溶液固定，常規制作電鏡樣品，超薄切片，透射電鏡觀察各組之間受試部位皮膚病理學形態差異。

2結果

2.1大體觀察

除空白對照組外，其他組動物在造模期間照射部位皮膚出現不同程度的皮損，如紅疹、潰瘍、結痂等。實驗結束時，空白對照組大鼠皮膚正常，肉眼未見皮損，表皮厚薄均勻；模型組大鼠紫外線輻射部位皮膚表面出現局部紅疹、潰瘍、結痂，表皮厚薄不均；維生素C組大鼠紫外線輻射部位皮膚表面出現少量紅疹、潰瘍、結痂，表皮厚度增厚，程度都較模型組減輕。(圖1見文后彩插1)。

2.2皮膚組織H&E、Masson’s trichrome、Victoria blue B染色結果

經H&E染色后，空白對照組皮膚表皮厚薄均勻，皮脂腺未見明顯增生；模型組紫外線照射部位皮膚表面局部壞死結痂，表皮細胞明顯增生，表皮厚度明顯增厚，厚薄不均，真皮層血管擴張、炎細胞浸潤、成纖維細胞增生，皮脂腺明顯增生，毛囊明顯增大；維生素C組皮膚真皮間質血管擴張、炎細胞浸潤、成纖維細胞增生較模型組減輕。圖2，見文后彩插1。

經Masson’s trichrome染色后，空白對照組膠原纖維呈藍色，彈力纖維呈紅色，膠原纖維豐富，彈力纖維較均勻的散在分布在膠原束之間；模型組真皮層纖維排列較亂，彈力纖維變性、局灶性蓄積、增粗、排列紊亂；維生素C組皮膚真皮層纖維排列較規整，彈力纖維變性、局灶性蓄積較模型組減輕。(圖3見文后彩插2)。

經Victoria blue B染色后，空白對照組見膠原纖維呈紅色，彈力纖維呈藍綠色，彈力纖維較均勻地分布在膠原束之間，數量較膠原纖維少；模型組見彈力纖維變性、局灶性蓄積、增粗、排列紊亂；維生素C組見彈力纖維變性、局灶性蓄積較模型組減輕。(圖4見文后彩插2)。

2.3電鏡檢測

空白對照組表皮細胞之間間隙小，細胞間可見橋粒連接，表皮基底膜完整，真皮纖維排列整齊，成纖維細胞散在稀少，膠原纖維橫截面大小較均一，膠原纖維縱切面周期性橫紋清晰可見，成纖維細胞形態正常，胞質內見大量粗面內質網，內質網未見擴張，線粒體未見空泡化，真皮間質血管未見明顯擴張充血；模型組表皮細胞之間間隙明顯增寬，局部表皮基底膜中斷、不連續，真皮纖維排列較亂，真皮層成纖維細胞數目明顯增多，膠原纖維腫脹，膠原纖維橫斷面粗細不均，部分膠原纖維之間見較多致密物質，成纖維細胞內質網高度擴張，線粒體空泡化，局部成纖維細胞周圍見新生的網狀纖維和彈性纖維，真皮間質血管明顯擴張充血、出血；維生素C組表皮細胞之間間隙較模型組略減小，表皮基底膜完整，真皮纖維排列較整齊，成纖維細胞數目較模型組減少，膠原纖維橫斷面粗細較均一，膠原纖維縱切面周期性橫紋較清晰，成纖維細胞內質網輕度擴張，間質血管擴張充血、出血較模型組減輕。各組真皮成纖維細胞數目、內質網和線粒體膠原纖維的微觀結構變化見圖5、6、7。

3討論

本研究采用UVA+UVB紫外線輻射的方法，成功建立了光老化大鼠模型，此模型可以廣泛用于抗光老化藥物的藥效學篩選。SD大鼠由于價格低廉、適用性廣、可取材面積大，被本研究選用作為造模動物。楊汝斌等[5]采用UVA+UVB輻射成功建立SD大鼠光老化模型，造模結束時UVA、UVB輻照強度累計分別為148.5 J/cm2和21.38 J/cm2。在楊研究的基礎上，本研究采用了更接近日光UVA、UVB比例的輻射參數，更模擬日常光老化環境，大鼠光老化皮膚模型的病理改變和楊報道的基本一致，損傷程度也相應減輕。本研究詳細闡述了模型建立之后照射皮膚病理結構上的改變，也通過使用公認的抗氧化劑維生素C的干預，表明維生素C在一定程度上可以改善光老化大鼠表皮和真皮層皮膚的結構，具有一定的光保護作用，同時也驗證了模型的有效性。我們通過本研究其他數據(本文未列出)推測其作用機制可能與增加皮膚中HYP含量，提高皮膚III型膠原蛋白水平有關。有一點需要說明的是，在我們的實驗中，維生素C干預的大鼠個體差異比較大，療效參差不齊。結合文獻分析，我們認為導致上述結果的原因可能是由于口服補充抗氧化劑，受到溶解性、皮膚滲透效率、存儲過程不穩定等因素的限制，皮膚生物利用度下降[6]。

國內外研究表明，外用或口服抗氧化劑可以改善紫外線輻射引起的皮膚損傷。Oresajo C等[7]研究發現外用含維生素C、阿魏酸和根皮素的抗氧化劑混合物，對紫外線誘導的光損傷人體皮膚有保護作用；Reeve VE等[8]研究發現小鼠口服寧夏枸杞漿汁可以通過抗氧化途徑減少由于紫外線輻射引起的皮膚損傷。針對口服補充抗氧化劑的局限性，目前國內外有一些方法可以提高皮膚的生物利用度，如通過外用補充皮膚抗氧化劑增強抗氧化防御、對維生素進行化學修飾、使用新膠體藥物遞送系統(如微乳液)等，可以達到更好的療效。

注: A-6：空白對照組；B-6：模型組；C-6：維生素C組。圖6　大鼠皮膚真皮層成纖維細胞內質網和線粒體微觀結構比較(標尺=0.5 μm)Note: A-6: Control group; B-6: Model group; C-6: Vitamin C group.Fig.6　Comparison of the microstructure of endoplasmic reticulum and mitochondria in dermis fibroblasts of rats with normal or UV-induced photoaged skin. Bar=0.5 μm.

注: A-7：空白對照組；B-7：模型組；C-7：維生素C組。圖7　大鼠皮膚膠原纖維微觀結構比較(標尺=0.5 μm)Note: A-7: Control group; B-7: Model group; C-7: Vitamin C group.Fig.7　Comparison of the microstructure of collagen fibers in rats with normal or UV-induced photoaged skin. Bar=0.5 μm.

參考文獻：采用順序編碼標注，按照引文先后順序，用阿拉伯數字連續編號。 格式如下：(1)期刊：著者(一、二、三名作者全列，三名以上只列前三名后加“，等”或“，et al．”)．文題[文獻標識碼]．刊名，出版年，卷:起-止頁. 。

[1]Masaki H. Role of antioxidants in the skin: anti-aging effects [J]. J Dermatol Sci, 2010, 58(2): 85-90.

[2]Godic A, Polj?ak B, Adamic M, et al. The role of antioxidants in skin cancer prevention and treatment [J]. Oxid Med Cell Longev, 2014: 860479.

[3]Baumann L, Duque DK, Schirripa MJ. Split-face vitamin C consumer preference study [J]. J Drugs Dermatol, 2014, 13(10): 1208-1213.

[4]Lin JR, Qin HH, Wu WY, et al. Vitamin C protects against UV irradiation-induced apoptosis through reactivating silenced tumor suppressor genes p21 and p16 in a Tet-dependent DNA demethylation manner in human skin cancer cells [J]. Cancer Biother Radiopharm, 2014, 29(6): 257-264.

[5]楊汝斌,萬屏,劉玲,等.SD大鼠皮膚光老化動物模型建立方法的探索 [J]. 中國皮膚性病學雜志, 2011, 25(3): 199-202.

[6]Ga?perlin M, Gosenca M. Main approaches for delivering antioxidant vitamins through the skin to prevent skin ageing [J]. Expert Opin Drug Deliv, 2011, 8(7): 905-919.

[7]Oresajo C, Stephens T, Hino PD, et al. Protective effects of a topical antioxidant mixture containing vitamin C, ferulic acid, and phloretin against ultraviolet-induced photodamage in human skin [J]. J Cosmet Dermatol, 2008, 7(4): 290-297.

[8]Reeve VE, Allanson M, Arun SJ, et al. Mice drinking goji berry juice (Lycium barbarum) are protected from UV radiation-induced skin damage via antioxidant pathways [J]. Photochem Photobiol Sci, 2010, 9(4): 601-607.

〔修回日期〕2015-04-27

《中國比較醫學雜志》論文書寫格式要求

1．題目應簡明扼要、準確地反映文章的主題，避免使用非公知公用的縮略語符號和代號。一般以20個字內為限，英文題名不宜超過10個實詞。中英文題名含義應一致。

2．作者姓名之間以逗號隔開，姓字母全部大寫，名第一個字母大寫，雙名之間加連字符(-)。作者單位要求同中文，后面加China．不同單位的作者，應在姓名右上角標上角碼。作者單位另起一行在作者姓名之下，包括單位全稱，所在城市名稱和郵編，兩端加圓括號。不同單位的作者，應在單位名稱前加上與作者名字相同的標識。如：

鏈脲佐菌素誘導1型糖尿病大鼠模型穩定性觀察

蔣升1，謝自敬1，張莉2

(1.新疆醫科大學第一臨床醫學院內分泌科, 烏魯木齊 830054; 2. 武警新疆總隊醫院眼科, 烏魯木齊830000)

Observation of Stability of Type I Diabetic Rat Models Induced by Streptozotocin

JIANG Sheng1, XIE Zi-jing1, ZHANG Li2

(1. Department of Endocrinology, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, China；

2. Xinjiang General Hospital of Chinese People's Armed Police Force, Urumqi 830091, China)

5．正文：格式和層次結構按照引言、材料和方法、結果、討論4部分撰寫。各層次標題應簡短明確，同一級標題應反映同一層次的內容 (格式為 1 1.1 1.2……2 2.1 2.2……) 。

凡在文中出現的生物名稱請用正確的中英文學名，并在第一次使用時提供其完整的拉丁學名。

凡可用文字說明者均不用圖表。每個圖表均應有圖表題。圖表題及其文字說明及注釋采用中英文兩種文字，先中文后英文。圖、表按照在文中出現的順序編號，圖表序號一律用阿拉伯數字。表格一律采用三線表。圖表置于正文中。如是彩圖，按照順序統一置于文章參考文獻后，作彩版使用。

(2)專著：著者(一、二、三名作者全列，三名以上只列前三名后加“，等”或“，et al．”).書名(版次)[文獻標識碼]. 出版地：出版者, 出版年：起-止頁.

(3) 論文集：著者(一、二、三名作者全列，三名以上只列前三名后加“，等”或“，et al．”). 文題[文獻標識碼]．見(In)：著者(一、二、三名作者全列，三名以上只列前三名后加“，等”或“，et al．”).論文集，出版地：出版者, 出版年：起-止頁.

研究報告

Effects of vitamin C on UV-induced photoaged skin in rats

LOU Cai-xia1, GAO Qing2, SUN Xia1, HUANG Wei1, ZHONG Zhi-yong1, KUANG Shao-song1, GE Ya-zhong2

(1. Laboratory of Comparative Medicine, Guangdong Medical Laboratory Animal Center, Foshan,

Guangdong 528248, China; 2. Infinitus (China) Co., Ltd., Guangzhou, Guangdong 510000,China)

【Abstract】ObjectiveTo study the protective effect of vitamin C on UV-induced photoaged skin structure in rats and provide a basis for clinical medicine and health care. Methods Photoaging skin models were set up by chronic ultraviolet radiation in 24 SPF female Sprague-Dawley rats, irradiated twice weekly for 4 weeks. The rat photoaged skin was induced by exposure to a total dose of 123 J/cm2UVA and 5 J/cm2UVB for 4 weeks. Vitamin C was administered by gastric gavage in a dose of 50 mg/kg once daily for 30 days during the model development. We compared the pathological changes in the irradiated skin using HE, Masson’s trichrome and Victoria blue B staining, and compared the ultrastructural changes by electron microscopy. ResultsRat models with photoaged skin were developed successfully. The vitamin C group showed significant reduction of pathological severity including erythema, ulcers, epidermal cell proliferation, epidermal thickness, dermis vasodilation, inflammatory cell infiltration, fibroblast proliferation, endoplasmic reticulum dilatation, mitochondrial swelling and vacuolization, elastic fibers degeneration and focal accumulation, collagen fibers swelling with uneven thickness,compared with the rats of model group at the irradiation site. ConclusionsVitamin C is effective in reducing the structural damage of UV-induced photoaged skin in rats.

【Key words】Vitamin C; Anti-photoaging; Skin structure; Model rat; Histopathology; Pathology; Electron microscopy

文獻標識碼按：期刊[J]、專著[M]、論文集[C]、標準[S]、學位論文[D]。 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.006.005

【中圖分類號】R-33 、英文

【文章編號】1671-7856(2015) 06-0023-05

[通訊作者]葛亞中，E-mail： Star.Ge@infinitus-int.com。

[作者簡介]樓彩霞(1983-)，女，博士，助理研究員，研究方向：藥理學和保健食品功能評價。E-mail： alou1218@163.com。 4．腳注(文章首頁左下方)：(1)基金項目(論文所受資助的課題基金來源及編號)；(2)(第一作者)；(3)通訊作者。第一作者和通訊作者簡介包括：姓名(生年-)、性別、職稱、學位、研究方向。

[基金項目]國家自然科學基金(編號：81403212)；廣東省醫學科研基金(編號：B2014062)；廣東省中醫藥管理局基金(編號：20142019)。