慢性束縛應激模型致焦慮和抑郁共病的行為學研究

孫秀萍，張　楠，高　杰，宋銘晶，秦　川

(1. 北京協和醫學院比較醫學中心 中國醫學科學院北京協和醫學院實驗動物研究所，

衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類動物模型三級實驗室 北京　100021)

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慢性束縛應激模型致焦慮和抑郁共病的行為學研究

孫秀萍，張楠，高杰，宋銘晶，秦川

(1. 北京協和醫學院比較醫學中心 中國醫學科學院北京協和醫學院實驗動物研究所，

衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類動物模型三級實驗室 北京100021)

【摘要】目的建立焦慮抑郁共病動物模型，為焦慮抑郁共病的神經生物學機制及治療方法的研究奠定基礎。方法C57BL/6J小鼠隨機分為正常組、模型組和西酞普蘭組。采用慢性束縛加孤養方法建模，模型組和西酞普蘭組每日束縛4 h(10:00～14:00)，連續進行35 d，單籠飼養。造模14 d后，正常組和模型組給予生理鹽水，西酞普蘭組給予西酞普蘭10 mg/kg，腹腔注射，注射劑量為0.1 mL/10 g，給藥時間為21 d。應用糖水偏愛實驗和強迫游泳實驗評價模型抑郁癥狀的轉化效度，應用空場實驗和高架十字迷宮實驗評價模型焦慮癥狀的轉化效度，同時觀察西酞普蘭對焦慮抑郁模型行為學改善作用。結果糖水偏愛實驗和強迫游泳實驗結果顯示，慢性束縛模型組糖水偏愛指數明顯下降，強迫游泳不動時間明顯延長，與正常組比較差異具有顯著性(P<0.01，P<0.01)。空場實驗結果顯示，模型組小鼠在中央區停留時間和運動路程明顯減少，與正常組比較差異具有顯著性(P<0.01，P<0.05)。西酞普蘭增加模型小鼠的中央區時間及中央區運動路程(P<0.05，P<0.05)。高架十字迷宮實驗結果顯示，模型組動物進入開臂次數比例及時間比例下降，與正常組比較具有顯著性差異(P<0.05，P<0.05)。西酞普蘭未能逆轉這種行為學改變。結論慢性束縛應激模型表現為焦慮抑郁共病，轉化效度穩定，可作為焦慮抑郁共病動物模型，用于焦慮抑郁共病生物學機制及其治療研究。

【關鍵詞】慢性束縛；應激；小鼠，焦慮癥，抑郁癥

近年來，焦慮癥和抑郁癥發病率不斷攀升。二者雖是相互獨立的疾病單元，但在臨床上共病發生率很高，約有一半的抑郁癥患者伴發焦慮癥[1]。應激因素是這兩種精神疾患的重要風險因子，因此應激動物模型廣泛應用于焦慮癥和抑郁癥神經生物學機制及其治療策略研究[2]。但目前，尚缺乏轉化效度穩定的焦慮、抑郁共病應激動物模型。動物實驗研究表明，非社會應激因素引起明顯的抑郁癥狀，但焦慮行為表現不穩定，而社會應激因素更多產生焦慮行為，所伴發的抑郁癥狀不穩定[3]。建立轉化效度更為穩定的焦慮抑郁共病動物模型，對臨床焦慮抑郁共病的治療具有重要意義。慢性束縛應激，作為非社會應激因素，廣泛應用于應激相關疾病的研究[4]。孤養，即將動物單籠飼養，對于群居動物，是一種社會應激因素。本研究復合非社會應激因素和社會應激因素，采用慢性束縛加孤養應激方式，研究小鼠的焦慮和抑郁共病行為，建立穩定的焦慮、抑郁共病動物模型，為焦慮抑郁共病的病理生理機制及治療研究奠定基礎。西酞普蘭(citalopram)是選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑，具有抗焦慮和抗抑郁雙重作用。本研究同時觀察西酞普蘭對焦慮抑郁共病動物模型行為的改善作用。

1材料和方法

1.1動物

C57BL/6J雄性小鼠，SPF級，體重25 g，30只。由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。許可證號：SCXK(京)2014-0004。動物使用許可證號：SYXK(京)2014-0029。動物自由進食進水，室內溫度：(23～25)℃，相對濕度：(55±10)%。維持12 h光照/12 h黑暗的晝夜節律。動物適應環境1周進行實驗。

1.2儀器

動物行為學視頻跟蹤系統(Noldus Information Technology，EthoVision XT，The Netherlands).

1.3實驗方法

動物隨機分為正常組、慢性束縛組、西酞普蘭組，每組10只。模型組和西酞普蘭組動物單籠飼養，慢性束縛方法參照文獻[5]，將動物置于50 mL 離心管(離心管上烙制直徑2 mm小孔數十個，用于通風)，每日束縛4 h(10:00～14:00)，連續進行35 d。正常組動物5只/籠，不給予任何干預，放置在另一房間。造模14 d后，正常組和模型組給予生理鹽水，西酞普蘭組給予西酞普蘭10 mg/kg。三組均腹腔注射，注射劑量為0.1 mL/10 g，給藥時間為21 d。造模結束，進行行為學實驗。

1.3.1糖水偏愛實驗:根據文獻報道[6]，糖水偏愛測試方法分為訓練期和測試期。訓練期內，使動物適應蔗糖飲水，第1個24 h，給予動物兩瓶1%蔗糖水，第2個24 h，給予動物1瓶1%蔗糖水，1瓶純水。測試前不禁食禁水，測試期，同樣給予動物1瓶1%蔗糖水，1瓶純水，測試時間為15 h。為避免位置偏愛影響因素，測試中間，將兩瓶位置互換。測試結束，計算糖水偏愛指數(糖水偏愛指數=糖水消耗/ 總液體消耗 × 100%)。

1.3.2空場實驗:方形空場環境尺寸為50 cm × 50 cm × 30 cm(長×寬×高)。中央區是以空場中心點為中心，邊長20 cm的正方形區域，邊緣區寬8 cm。將小鼠置于空場，觀察5 min 內的自發活動及在中央區和邊緣區的停留時間。實驗采用動物行為學視頻跟蹤系統，記錄動物的運動路程、速度及在各區的停留時間等。

1.3.3強迫游泳實驗:動物在測試房間適應1 h后，進行強迫游泳實驗。根據文獻[7]，將小鼠放入高20 cm，直徑12 cm，水深10 cm的圓形玻璃容器中，水溫25℃，觀察6 min，記錄后4 min內動物的累計不動時間。判定不動的標準是動物在水中停止掙扎，呈漂浮狀態，僅有細小的肢體運動以保持頭部浮在水面。

1.3.4高架十字迷宮實驗:高架十字迷宮由兩對相對開臂和兩對相對閉壁成十字交叉型組成，開壁尺寸為30 cm × 5 cm(長×寬)，閉臂尺寸為30 cm × 5 cm × 15 cm(長×寬×高)，中央區尺寸為5 × 5 cm，連接四壁。四壁距離地面100 cm。根據文獻[8]，將動物面對開臂方向，放在中央區，觀察動物在開臂和閉臂中的活動情況。實驗采用動物行為學視頻跟蹤系統，記錄動物進入開壁時間(open arm time，OT)和次數(open arm entry，OE)，進入閉壁的時間(close arm time，CT)和次數(close arm entry，CE)。計算動物進入開壁次數比例(OE%=OE/(OE + CE) × 100%)以及開壁時間比例(OT%=OT/(OT + CT) × 100%)。

1.4統計學方法

2結果

2.1 慢性束縛模型對小鼠糖水偏愛實驗的影響

如圖1所示，慢性束縛模型組糖水偏愛指數下降，與正常組比較，差異具有極顯著性(P<0.01)。西酞普蘭提高模型組糖水偏愛指數，差異具有顯著性(P<0.05)。

圖1　慢性束縛模型對糖水偏愛指數的影響，與正常組比較；# P<0.05，與模型組比較)Fig.1　Effect of chronic restraint stress on the sucrose preference test in the mice ±s， ** P<0.01, compared with the control group; # P<0.05, compared with the model group)

2.2 慢性束縛模型對小鼠強迫游泳實驗的影響

如圖2所示，慢性束縛模型組強迫游泳不動時間顯著延長，與正常組比較，差異具有極顯著性(P<0.01)。西酞普蘭縮短強迫游泳不動時間，與模型組比較，差異具有顯著性(P<0.05)。

圖2　慢性束縛模型對強迫游泳實驗的影響，與正常組比較；# P<0.05，與模型組比較)Fig.2　Effect of forced swim test on the immobility time in the compared with the control group; # P<0.05, compared with the model group)

2.3 慢性束縛模型對小鼠空場實驗的影響

如圖3A和3B所示，慢性束縛模型組和正常組小鼠的運動路程和運動速度無顯著性差異，表明慢性束縛的應激方式未影響動物的運動能力。如圖3C所示，模型組小鼠在中央區時間明顯減少，與正常組相比，差異具有極顯著性(P<0.01)；西酞普蘭增加小鼠的中央區時間，與模型組相比，差異具有顯著性(P<0.05)。如圖3D所示，模型組小鼠在中央區運動路程明顯減少，與正常組相比，具有顯著差異(P<0.05)；西酞普蘭增加小鼠的中央區運動路程，與模型組相比，具有顯著性差異(P<0.05)。

2.4 慢性束縛模型對小鼠高架十字迷宮的影響

如圖4A所示，慢性束縛模型減少小鼠進入開臂次數比例，與正常組相比，差異具有顯著性(P<0.05)；西酞普蘭組進入開臂次數比例增加，但與模型組相比差異無顯著性(P=0.055)。如圖4B所示，慢性束縛模型減少小鼠進入開臂時間比例，與正常組相比，差異具有顯著性(P<0.05)；西酞普蘭組進入開臂次數比例增加，但與模型組相比差異無顯著性。

圖3　慢性束縛模型對空場實驗的影響，與正常組比較；# P<0.05，與模型組比較)Fig.3　Effect of chronic restraint stress on open field test in the mice ±s ** P<0.01, compared with the control group; # P<0.05, compared with the model group)

圖4　慢性束縛模型對高架十字迷宮實驗的影響±s， * P<0.05，與正常組比較)Fig.4　Effect of chronic restraint stress on elevated plus maze test in the mice ±s， * P<0.05，compared with the control group)

3討論

動物模型的轉化效度評價包括表觀效度(face validity)、預測效度(predictive validity)和結構效度(construct validity)三個層面[9]。表觀效度指動物模型中動物和人類之間癥狀學的相似性。預測效度指治療藥物能有效干預動物模型的相應癥狀表現，結構效度指模型與某個假說理論的符合程度。本研究基于應激是焦慮癥、抑郁癥等精神疾患的重要風險因子理論，研究了小鼠接受非社會因素(慢性束縛)和社會因素(孤養)疊加應激后的焦慮及抑郁行為表現，并觀察西酞普蘭(具有抗抑郁和抗焦慮雙重作用)對模型焦慮和抑郁行為的改善作用。因此本研究從表觀效度、預測效度和結構效度三個方面考察了慢性束縛小鼠模型的轉化效度。

快感缺失是動物抑郁行為最為核心的癥狀之一，嚙齒類動物快感缺失的定量評價方法主要為糖水偏愛實驗 (sucrose preference test)[10]。該行為學評價方法基于嚙齒類動物(主要為大小鼠)喜好糖水的天性, 是目前使用最為廣泛的用于評價快感缺失的動物行為學測試方法。本研究結果顯示，經過35 d的慢性束縛應激，模型小鼠的糖水偏愛指數明顯下降，與正常組比較差異具有極顯著性。強迫游泳實驗是動物被迫在一個局限的空間游泳，首先試圖掙扎逃跑，隨后處于一種間歇性不動狀態，這種狀態被稱為“行為絕望”，與人類抑郁癥相似[11]。本研究結果表明，模型小鼠強迫游泳的不動時間顯著延長。糖水偏愛實驗和強迫游泳實驗結果提示模型小鼠出現抑郁樣行為。

動物焦慮行為學評價方法主要基于動物對新環境既產生恐懼又產生探究的矛盾心理沖突[12]。空場實驗中，中央區對動物來說，是未知的威脅情景，焦慮水平高的動物由于對陌生環境的恐懼，主要在邊緣區域活動，而在中央區域活動較少[13]。本研究結果顯示，慢性束縛應激模型小鼠在中央區的停留時間及運動路程明顯減少，提示模型出現焦慮行為。高架十字迷宮實驗中，由于開臂和外界相通，對動物來說具有一定的新奇性同時又具有一定的威脅性，焦慮水平高的動物會離開開臂退縮到閉臂中，反之則在開臂停留更多的時間，對開臂的探究次數也增多。本研究結果顯示，慢性束縛應激模型小鼠進入開壁的時間比例和次數比例均顯著下降，提示產生焦慮行為，與空場實驗結果一致。

以上實驗結果提示，經過35 d的慢性束縛加孤養，小鼠同時表現出抑郁和焦慮行為，提示慢性束縛應激模型具有較好的抑郁焦慮共病表觀效度。

西酞普蘭為選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑，具有抗抑郁和抗焦慮雙重作用[14]。本研究中，西酞普蘭可提高慢性束縛模型的糖水偏愛指數，縮短強迫游泳不動時間，顯示其良好的抗抑郁作用。同時，西酞普蘭可增加模型小鼠空場實驗中在中央區的停留時間和運動路程，顯示其抗焦慮作用。但是，西酞普蘭對高架十字迷宮中，模型小鼠進入開臂的次數和時間比例無影響，這可能與動物在高架十字迷宮實驗中的個體差異較大有關。西酞普蘭的上述作用提示慢性束縛應激模型具有較好的預測效度。

綜上所述，慢性束縛應激模型表現為焦慮抑郁共病，西酞普蘭可逆轉這些行為學改變。該模型可作為焦慮抑郁共病動物模型，用于焦慮抑郁共病神經生物學機制及其治療研究。

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〔修回日期〕2015-05-07

研究報告

Chronic restraint stress produces comobidity behavior of

anxiety and depression disorders in mice

SUN Xiu-ping, ZHANG Nan, GAO Jie, SONG Ming-jing, QIN Chuan

(1.Comparative Medicine Center，Peking Union Medical College (PUMC), and Institute of

Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS); Key Laboratory of

Human Disease Comparative Medicine, Ministry of Health; Key Laboratory of Human

Disease Animal Models, State Administration of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100021, China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of chronic restraint stress on the comobidity behavior of anxiety and depression disorders in mice. MethodC57BL/6J mice were randomly divided into 3 groups (n=10 per group): control (normal saline), chronic restraint stress (normal saline), and positive control (citalopram, 10 mg/kg). Citalopram and normal saline were administered by intraperitoneal injection. Chronic restraint stress and individual housing was applied to establish the stress model. The mice were individually housed and restrained for 4 h per day in a 50-mL polypropylene conical tube with ventilation holes. This daily restraint was repeated for 35 consecutive days. Sucrose preference test and forced swim test were applied to evaluate the depressive behavior of the mice. Open field test and elevated plus maze test were used to assess the anxiety effect of chronic restraint stress in the mice. ResultsThe sucrose intake was significantly reduced in the chronic restraint stress models compared with the control mice (P<0.01). The immobility time was increased in the forced swim test (P<0.01). The cumulative duration and distance moved in the center were decreased in the open field test(P<0.01，P<0.05). Chronic treatment with citalopram reversed the above mentioned behavior change. The open arm entry and open arm time were decreased in the elevated plus maze test (P<0.05，P<0.05). Citalopram did not reverse this behavior change. ConclusionsMouse models created by chronic restraint and individual housing stress display both anxiety and depressive behavior making them a potent animal model in the treatment of comorbidity of anxiety and depression disorders.

【Key words】chronic restraint; stress; mice; anxiety; depression

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.006.004

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2015) 06-0018-05

[通訊作者]秦川，研究員，E-mail: qinchuan@pumc.edu.cn。

[作者簡介]孫秀萍(1974-)，女，助理研究員，博士，研究方向：神經精神疾病藥理及方法學。

[基金項目]北京市自然科學基金資助項目(資助編號：7142105)。