PSGL-1缺失導致MDSCs上調

周澤啟，李江超，張瀟涵，韓　露，葉宇翔，王麗京

(廣東藥學院血管生物學研究所，廣州　510006)

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PSGL-1缺失導致MDSCs上調

周澤啟，李江超，張瀟涵，韓露，葉宇翔，王麗京

(廣東藥學院血管生物學研究所，廣州510006)

【摘要】目的P-選凝素糖蛋白配體1(P-selectin glycoprotein ligand 1, PSGL-1)主要特異性表達在白細胞上，我們的研究PSGL-1缺失在小鼠體內脾臟、骨髓中MDSCs的變化。方法利用我們實驗室現有的PSGL-1-/-小鼠進行試驗，經過鑒定后，PSGL-1-/-后代小鼠；利用流式細胞術檢測C57和PSGL-1-/-小鼠脾臟、骨髓中Gr-1和CD11b陽性細胞的變化。結果與對照組C57小鼠相比，PSGL-1-/-基因工程小鼠MDSCs在脾臟、骨髓中顯著上調(P<0.001)，結論PSGL-1的缺失導致小鼠脾臟、骨髓中MDSCs升高。

【關鍵詞】PSGL-1；MDSCs；基因工程小鼠

P-選凝素糖蛋白配體1 (P-selectin glycoprotein ligand 1, PSGL-1)是90年代發現其為同源二聚體的一種跨膜的糖蛋白，表達于白細胞的膜表面[1，2]。在炎癥環境中，PSGL-1與P-選凝素的相互作用，促進白細胞與內皮細胞的黏附和滾動，在粘附的起始階段發揮著重要作用[3，4]。

在現有的報道中有人認為炎癥是能激發先天免疫和組織修復和再生，但是大多數人認為炎癥是促進機體逐步走向衰老、病態的一個誘因[5，6]。PSGL-1介導白細胞粘附的同時，還作為信號分子轉導胞外信號，促進白細胞活化，具有重要的生理意義[7，8]。最近在研究表明，PSGL-1在血小板與中性粒細胞結合中起到非常重要作用，當中性粒細胞無法結合血小板時，它們不能正常遷移，炎癥會減少[9，10]。在PSGL-1介導的粘附過程中發現，當PSGL-1敲除使其粘附血小板的能力降低，且白細胞向炎癥部位的爬行變慢。

腫瘤免疫作為一個新型的腫瘤研究方向，其作用方式和免疫應答相當復雜，涉及一系列的免疫分子及其之間的相互作用。髓系抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)作為一種免疫細胞在腫瘤逃逸中越來越引起關注，MDSCs主要參與腫瘤免疫逃逸、免疫抑制進而促進腫瘤的發生發展。MDSCs借助外源物質和腫瘤自身的特性進而幫助腫瘤實現逃逸功能。MDSCs主要是一群異質性細胞和粒細胞，巨噬細胞等的前體，在小鼠體內MDSCs即為CD11b+/Gr-1+雙陽性細胞，但是目前國際上對于人的MDSCs細胞還沒有明確的劃分，HLA-DR-CD14-CD33+CD11b被大多數人認可[11]。在本研究中采取的動物模型為，PSGL-1缺失的轉基因小鼠，其對照鼠采用其背景鼠C57。首先需要采取基因鑒定的方法鑒定其基因類型，在分別利用流式細胞術檢測其脾臟和骨髓中MDSCs的變化，在我們的實驗中我們發現其脾臟和骨髓中MDSCs顯著升高。

1材料和方法

1.1材料

PSGL-1-/-小鼠(B6.Cg-Selplgtm1Fur/J)均購買自美國Jackson實驗室，SPF環境中飼養擴群。C57BL/6小鼠購自廣東省醫學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK(粵)2008-0002。使用許可證號，SYXK(粵)2012-0125，PCR引物由Invitrogen公司合成，引物Mix購自thermo。Flowjo 進行流式分析。

1.2方法

1.2.1小鼠飼養和鑒定：所有小鼠均于SPF級環境下飼養，現將購買的PSGL-1-/-小鼠與C57進行雜交，得到后代中鑒定其基因型，將PSGL-1+/-雄鼠和PSGL-1+/-雌鼠雜交，得到的子代有三種情況PSGL-1+/-、PSGL-1+/+、PSGL-1-/-，經鑒定后得到實驗鼠PSGL-1-/-小鼠和對照鼠PSGL-1+/+。PSGL-1小鼠鑒定引物序列為：P1：5′-AGCTTC CTTGTGCTG CTGAC-3′，P2：5′-TCAAAATCGTCATCCCCAAC-3′，P3：5-′CCTTCTATCGCCTTCTTGACG-3′。PCR反應條件為：94℃預變性5 min，94℃ /30 s、65℃ /1 min、72℃/1 min，35個循環；72℃延伸2 min。P1和P2是鑒定野生型條帶，擴增條帶為140 bp，P2和P3是鑒定突變型條帶，擴增條帶為500 bp，用1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR結果，紫外燈下觀察結果并拍照。

1.2.2脾臟MDSCs細胞檢測：取8周的PSGL-1-/-、PSGL-1+/+小鼠各6只，眼眶取血，去脾臟用PBS在尼龍篩網上進行研磨，取研磨下層的細胞液，用紅細胞裂解液進行裂解15 min，離心，進行計數，取大約1×106個細胞數，350 r/min，5 min;棄上清液，用紙吸干管口液體，1 mL 0.5% BSA重懸細胞液，離心，350 r/min，5 min，加入工作液,，避光孵育30 min，棄上清液，洗1～2次，上機檢測。

1.2.3骨髓MDSCs細胞檢測： 對上述分組小鼠，取完脾臟后將后腿剪下，抽取骨髓，同上述步驟檢測。

2結果

2.1 PSGL-1缺失小鼠脾臟中MDSCs上調

脾臟是人和脊椎動物最大的淋巴器官，同時也是機體最大的免疫器官。取C57小鼠和PSGL-1-/-小鼠的脾臟進行單細胞懸液的制備，而后用流式細胞術技術標記Gr-1和CD11b兩種抗體，檢測結果顯示在PSGL-1缺失小鼠中兩者雙陽性細胞即MDSCs細胞急劇上升，與正常小鼠對比，統計結果見圖1，差異明顯(P<0.001)。

圖1　PSGL-1缺失小鼠脾臟中MDSCs上調Fig.1　MDSCs are upregulated in the spleen of the PSGL-1-/- mice

2.2 PSGL-1缺失小鼠骨髓中MDSCs上調

骨髓不但是造血器官，它還是重要的免疫器官。在上述脾臟中我們看到MDSCs急劇上升，但是在白細胞大量來源地的骨髓是否也有同樣結果，我們不得而知，所以接下來我們進行骨髓方面的實驗，實驗結果顯示，同脾臟一樣，MDSCs也是急劇上升，差異明顯(P<0.001)。具體結果見圖2。

圖2　PSGL-1缺失小鼠骨髓中MDSCs上調Fig.2　MDSCs are upregulated in the bone marrow of the PSGL-1-/- mice

3討論

在炎癥環境中，白細胞的滾動粘附起著重要作用，今年來研究發現的PSGL-1與其配體P-selectin在粘附的起始階段發揮著重要作用[12]。其主要作用是由PSGL-1介導的信號級連反應來完成具有重要的生理意義。PSGL-1有三個與其對應的選凝素，其中造血祖細胞向骨髓的歸巢以及細胞的分化是由E-selectin介導完成[13]。研究還發現PSGL-1能參與趨化因子的趨化反應，如PSGL-1與CCL19(chemokine (C-C motif) ligand 19)和CCL21(chemokine (C-C motif) ligand 21)結合，并支持其趨化反應。也有文獻報道PSGL-1和多發性骨髓瘤的發病機理有關系[14-15]。提示PSGL-1可能與腫瘤發生發展和轉移密切相關。上述研究表明，PSGL-1在炎癥反應中和血液腫瘤中發揮重要作用。

在不同器官，不同組織中，和不同病理條件下(炎癥，腫瘤等環境)，MDSCs的表達會有所差異。受細胞因子的作用，這些髓系來源的前體細胞成熟受阻，因而停留在各個分化階段，成為具有免疫抑制功能的MDSCs。當在病理條件下，特別是腫瘤情況下，通過自分泌或旁分泌細胞因子，進而抑制T細胞正常功能，影響機體免疫。有研究報道靶向MDSCs的藥物研究能有效抑制黑色素瘤患者的病理進程，且患者兩年生存率良好。所以在此基礎上我們的研究才顯得意義重大。通過我們的實驗研究，發現在PSGL-1缺失小鼠中Gr-1和CD11b雙陽性細胞急劇上升，且統計學差異顯著(P<0.001),提示我們PSGL-1對機體免疫防護有著重要指示作用。本研究的創新點在于揭示PSGL-1在免疫中MDSCs升高，且差異顯著。最新研究表明PSGL-1介導中性粒細胞引起的血小板黏附，阻斷PSGL-1時炎癥加劇，我們和其他研究者的結果揭示PSGL-1在人體機體免疫中發揮重要作用。

參考文獻：

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〔修回日期〕2014-05-04

2015年《中國實驗動物學報》《中國比較醫學雜志》組織專題計劃

2015年《中國實驗動物學報》《中國比較醫學雜志》將計劃由以下編委組織7期高水平專題：(1)顧為望教授：小型豬在生物醫藥研究中的應用(已完成)；(2)范慧敏教授：實驗動物心肺移植模型的建立及相關研究(已完成)；(3)范永升教授：中醫藥研究與“病癥”結合動物模型(雜志截稿日期：2015年2月28日)；(4)高誠教授：實驗動物質量檢測、標識標記、模型和評價(學報截稿日期：2015年5月31日)；(5)王強教授：斑馬魚在發育生物學及實驗動物模型中的應用(學報截稿日期：2015年7月31日)；(6)代解杰教授：實驗動物新資源標準化研究及疾病動物模型的創建(雜志截稿日期：2015年8月31日)；(7)肖杭教授：實驗動物在藥理毒理方面的應用研究(雜志截稿日期：2015年9月30日)。

歡迎全國的同道積極參與符合上述專題內容的論文撰寫、投稿，請注意各個專題的截稿日期；論文可以通過《中國實驗動物學報》網站(http://zgsydw.alljournal.ac.cn/sydwybjyx/ch/index.aspx)；《中國比較醫學雜志》網站(http://zgsydw.alljournal.ac.cn/zgbjyxzz/ch/index.aspx)上的兩刊遠程稿件管理系統注冊并投稿(請在投稿后，在“消息管理”中向編輯部發送消息，注明是哪個專題)，收到后將與上述各位教授所組織的專題論文一起進行嚴謹的審稿，入選論文將在兩刊專題中刊出。我刊還特別歡迎各位專家教授撰寫有學術導向和指導意義的評論性文章(包括專家論壇、專論、學術爭鳴，等等)，此類論文可以隨時通過Email直接發送到郵箱：b67761337@126.com。相信在各位編委、審稿專家和廣大實驗動物工作者的積極參與下，我刊2015年的學術質量和影響力度會更上一層樓。

《中國實驗動物學報》《中國比較醫學雜志》編輯部

研究報告

MDSCs are upregulated in PSGL-1-deficient mice

ZHOU Ze-qi，LI Jiang-chao，ZHANG Xiao-han, HAN Lu，YE Yu-xiang，WANG Li-jing

(Vascular Biology Center, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China)

【Abstract】Objective PSGL-1 is specifically expressed in leucocytes. The aim of this study was to explore the changes of myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) in the spleen and bone marrow in PSGL-1-deficient mice. Methods PSGL-1-/-mice were used in the experiment. After identification of the offsprings, flow cytometry was used to test the expression of CD11b and Gr-1 in C57 and PSGL-1-/-mice. ResultsCompared with the C57 mice, the expression of MDSCs was up-regulated in the PSGL-1-deficient mice (P<0.001). Conclusion The expression of MDSCs is upregulated in PSGl-1-deficient mice.

【Key words】P-selectin glycoprotein ligand 1, PSGL-1; Myeloid-derived suppressor cells, MDSCs; Spleen; Bone marrow; Transgenic mice; PSGL-1-deficient mice

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.006.009

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2015) 06-0042-04

[通訊作者]王麗京，女，教授，E-mail： wanglijing62@163.com。

[作者簡介]周澤啟，男，碩士，E-mail： zhouzeqi199131@163.com。

[基金項目]國家自然科學基金資助項目(44164007;81472336)和 廣東省醫學科研基金，項目號： A2013312。