視網膜血管鋪片技術的改進

徐玉環，徐艷峰，劉　穎，黃　瀾，李彥紅，韓云林，鄧　巍，

許慶剛2，秦　川1，朱　華1

(1. 中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，

國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室,北京　100021;

2. 首都醫科大學附屬北京同仁醫院,北京　100730)

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視網膜血管鋪片技術的改進

徐玉環1，徐艷峰1，劉穎1，黃瀾1，李彥紅1，韓云林1，鄧巍1，

許慶剛2，秦川1，朱華1

(1. 中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，

國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室,北京100021;

2. 首都醫科大學附屬北京同仁醫院,北京100730)

【摘要】目的探討視網膜血管鋪片技術的改進及在實驗動物小鼠，大鼠，狗和猴中的應用。 方法 應用蛋白酶K-胰蛋白酶聯合消化法制備視網膜血管鋪片，行HE及PAS染色觀察血管形態，免疫組化方法觀察CD31及VEGF的表達。結果用改進方法制備的視網膜血管鋪片，血管網完整，無神經組織殘留，可清晰顯示血管走向。各級血管形態清晰，血管分支清楚完整，無斷裂現象。血管內皮細胞形態清晰。CD31在血管周細胞及內皮細胞均有表達；VEGF主要在內皮細胞表達。結論改進的視網膜血管鋪片技術可成功應用于不同實驗動物，為視網膜血管性疾病的研究提供了重要途徑。

【關鍵詞】視網膜血管鋪片; 聯合消化法; 抗原修復

視網膜是由大腦向外延伸的視覺神經末梢組織，其結構復雜、精細、脆弱而代謝旺盛。其血管屬于終末血管系統，任何病理性的破壞和血管梗阻等引起的組織缺氧，均能導致組織壞死，使其喪失感受和傳導光刺激的功能。因此血管改變是視網膜病變的重要特點。視網膜血管鋪片是研究視網膜血管病變的重要技術。但這項技術的消化時間不宜掌握，展片難度大，很難制備出理想的視網膜血管鋪片。國內外學者多采用胰蛋白酶直接消化或胃蛋白酶-胰蛋白酶聯合消化制備視網膜血管鋪片。在本研究中，我們總結前人經驗，不斷摸索改進，建立了新的視網膜血管鋪片技術，現總結如下。

1材料和方法

1.1材料

BALB/c小鼠來源于軍事醫學科學院實驗動物中心【SCXK(軍)2012-0004】，SD大鼠購自中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究中心【SCXK(京)2012-0001】，SYXK(京)2013-0019。犬購自北京日新科技有限公司【SCXK(京)2011-0007】，恒河猴由中國醫學科學院醫學實驗動物研究所提供【SCXK(京)2014-0011】，SYXK(京)2010-0030。蘇木素及伊紅Y染色液均為國產試劑(益利精細)，高碘酸(批號011108，北京)，Schiff(UFG0108，上海)， Proteinase K (CALBIOCHEM, cat#539480)，Trypsin 1:250 Porcine Pancreas(AMRESCO, lot#2861C173), anti-CD31 antibody(ABCAM, ab28364), anti-VEGF antibody(BOSTER，cat#BA0407), 兔超敏二步法免疫組化檢測試劑 (中杉金橋，PV-9001)。正常羊血清工作液(中杉金橋，ZLI-9056)，抗體稀釋液(中杉金橋，ZLI-9030)。

1.2方法

1.2.1大鼠視網膜血管鋪片的制備

大鼠脫頸椎法處死，摘取眼球，固定于10%中性福爾馬林。

沿距齒緣剪開眼球去除晶狀體，用蒸餾水漂洗，以視神經乳頭為中心將眼球壁均勻地剪成4份，剝離眼球壁視網膜層，再用蒸餾水漂洗。

將剝離出的視網膜放在蒸餾水中37℃孵育1～2 h，蒸餾水漂洗，孵育后的視網膜放入1 g/L的蛋白酶K中，56℃消化13～17min，去除消化掉的感光層細胞，蒸餾水漂洗，再將視網膜層放入3%胰蛋白酶消化液中，37℃消化40～60 min。

用吸管將半透明狀的血管網移入蒸餾水中漂洗，用吸管輕輕吹打非透明狀區域，直到血管網成透明狀, 再將吹打成透明狀的血管網鋪到含多聚賴氨酸的載玻片上，展平，自然干燥。

在消化過程中，蛋白酶k消化時，每5 min輕柔搖動一次，再以最低完成消化時間為觀察起點：蛋白酶K消化13 min時，肉眼觀察，輕柔搖動，若見感光層細胞脫落，即完成第一步消化。若消化不完全，每2 min輕柔搖動觀察一次，直至感光層脫落。胰蛋白酶消化時，每10 min輕柔搖動一次，也是以最低完成消化時間為觀察起點，若消化不完全，每5min輕柔搖動觀察一次。

1.2.2不同動物的視網膜在消化酶中的消化時間

在大鼠鋪片基礎上，我們摸索了BALB/c小鼠，犬和恒河猴視網膜血管鋪片的消化時間表1。BALB/c小鼠眼球小，在剝取視網膜層之前，要將眼球壁均勻剪成2份。犬和恒河猴眼球較大，結構特殊，取材后需立即固定4h，再用鋒利的刀片在眼球的上下部各切開一個小口，繼續固定24h。將眼球壁均勻地剪成若干等份，每一等份大小約0.4 cm×0.4 cm，再剝離視網膜層。

表1　不同動物的視網膜在消化酶中的消化時間

1.2.3視網膜血管鋪片HE染色

將視網膜血管鋪片置于自來水中水化15 min，蘇木蘇染核1 min，自來水沖洗，伊紅復染2 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.2.4視網膜血管鋪片PAS染色

PAS染色方法參照文獻[1]：將視網膜血管鋪片置于自來水中水化15 min，蒸餾水洗2次，加入高碘酸氧化10 min，蒸餾水速洗2次，加入schiff試劑反應5 min，自來水流水沖洗2 min，蘇木素染核2 min，自來水返藍5 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.2.5視網膜血管鋪片免疫組化染色

免疫組化染色方法參照文獻[2]，略有改變：①將視網膜血管鋪片置于PBS中水化15 min；②微波中火修復5 min；③3%雙氧水封閉15 min；④正常羊血清工作液封閉20 min；⑤滴加用抗體稀釋液稀釋的一抗(CD31稀釋度為1∶50；VEGF稀釋度為1∶200)，室溫孵育1.5 h；⑥滴加二抗試劑1，室溫孵育10 min；⑦滴加二抗試劑2，室溫孵育10 min； ⑧ DAB顯色；⑨蘇木素復染4 s;⑩梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片

2結果

2.1大鼠視網膜血管鋪片

經HE及PAS染色可見：鋪片完整，清晰顯示血管走向。各級血管形態清晰，血管分支清楚完整，無斷裂現象。細胞形態清晰，細胞核可清晰顯示(彩插12圖1)。

酶消化會造成部分抗原的丟失，因此需要對抗原進行修復。修復溫度太低造成修復不完全，溫度太高又會脫片。經過摸索，我們發現，微波中火5min即可將抗原修復。免疫組化結果顯示：CD31和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在正常大鼠鋪片均有表達：CD31在血管周細胞及內皮細胞均有表達；VEGF主要在內皮細胞表達。

2.2小鼠、狗、猴視網膜鋪片

根據大鼠鋪片經驗，我們摸索了BALB/c小鼠，犬和恒河猴的視網膜血管鋪片消化時間。經HE及PAS染色，可見血管網完整，無神經組織殘留。各級血管結構清楚，大動物小動脈可顯示血管壁的平滑肌。毛細血管網由內皮細胞和周細胞組成，細胞形態清晰，細胞核結構清楚(彩插12圖2)。

3討論

1960年Kuwabara[3]用胰蛋白酶對視網膜進行消化制備了視網膜血管鋪片，為視網膜血管的研究提供了一種新的手段。1963年Ashton[4]改進了Kuwabara的方法，用胃蛋白酶-胰蛋白酶聯合消化法，成功制備了貓的視網膜血管鋪片。此后又經過各國學者的不斷努力[5-8]，才有了今天的技術基礎。

視網膜血管消化鋪片技術難度較大：消化不完全，鋪片不能充分顯示出血管。消化過度，又會造成血管結構不清晰，甚至斷裂，直接影響對實驗結果的觀察和分析。蛋白酶K是一種高活性蛋白酶，能快速、有效地裂解組織細胞，因此在本研究中，我們選擇先用蛋白酶K消化掉視網膜感光層細胞。同時，蛋白酶K能穿透細胞膜，破壞細胞核，于是我們將視網膜層漂洗后再移入到3%胰蛋白酶中進一步消化。應用蛋白酶K-胰蛋白酶聯合消化法，成功制備了不同實驗動物的視網膜血管鋪片。

視網膜血管鋪片制備過程中，應注意以下幾點：①眼球的固定：大、小鼠眼球取材后直接固定于10%中性福爾馬林24 h以上。狗和猴眼球組織結構特殊，各部分組織結構的軟硬度不同，因此取材后立即固定4 h，再用鋒利的刀片在眼球的上下部各切開一個小口，繼續固定24 h。由于固定液易造成視網膜血管的斷裂，因此固定時間最好不超過72 h。②視網膜的剝離：視網膜位于眼球壁的內層，組織比較薄，而且附著在色素層上，剝離過程中很容易破碎。因此去除晶狀體后，以視神經乳頭為中心，將眼球壁剪開成若干等份，輕輕剝離出視網膜。③血管的消化：消化過程中，隨時注意觀察。蛋白酶K消化能力極強，每5 min輕微搖動一次，再以最低完成消化時間為觀察起點，每2 min輕柔搖動一次，待肉眼可見感光層脫落即可終止消化。換成胰蛋白酶消化時，每10 min輕微搖動一次，再以最低完成消化時間為觀察起點，每5 min輕柔搖動一次，待可見半透明血管網即終止消化。④鋪片：將消化好的血管網漂洗干凈，平鋪于含多聚賴氨酸的載玻片上，不要將載玻片上的水吸干凈，否則未貼壁的血管網漂移，影響對血管走向的觀察。⑤抗原修復：常規微波修復石蠟切片需要高火3 min，中火5 min，再低火3 min。而視網膜血管鋪片只需中火5 min即可完成抗原修復。

蛋白酶K-胰蛋白酶聯合消化法制備大鼠視網膜血管鋪片成功率高，穩定性好，同時也適用于不同實驗動物，為視網膜血管性疾病的研究提供了重要途徑。

參考文獻：

[1]李彥紅，朱華，徐艷峰，等. 過敏性紫癜兔模型的免疫學改變及機制初探[J].中國實驗動物學報. 2013, 21(6): 65-69.

[2]朱華，徐艷峰，劉穎，等. 鏈脲佐菌素誘導糖尿病恒河猴胰島細胞數量的變化[J]. 中國比較醫學雜志. 2012, 22(12): 1-3.

[3]Kuwabara T, Cogan DG. Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture [J]. Arch Ophthalmol.1960, 64(6): 904-911.

[4]Ashton N. Studies of the retinal capillaries in relation to diabetic and other retinopathies [J]. Brit J Ophthal.1963, 47(9): 521-538.

[5]Hammes HP, Lin J, Renner O,etal. Pericytes and the pathogenesis of diabetic retinopathy[J]. Diabetes. 2002, 51(10): 3107-3112.

[6]Ruberte J, Ayuso E, Navarro M,etal. Increased ocular levels of IGF-1 in transgenic mice lead to diabetes-like eye disease[J]. J Clin Invest. 2004, 113(8):1149-1157.

[7]HuangHuang Q, Wang S, Sorenson CM, et al. PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration[J]. Exp Eye Res. 2008, 87(3): 226-241.

[9]Zhu Y, Zhang XL, Zhu BF,etal. Effect of antioxidant N-acetylcysteine on diabetic retinopathy and expression of VEGF and ICAM-1 from retinal blood vessels of diabetic rats[J]. Mol Biol Rep. 2012, 39(4): 3727-3735.

〔修回日期〕

技術方法

A modification of retinal vascular preparation

XU Yu-huan1，XU Yan-feng1，LIU Ying1，HUANG Lan1，LI Yan-hong1，

HAN Yun-lin1，DENG Wei1，XU Qing-gang2，QIN Chuan1，ZHU Hua1

(1. Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of medical Sciences. Key Laboratory of Human

Disease Comparative Medicine, Ministry of Health, Key Laboratory of Human Diseases Animal Model, State

Administration of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100021, China; 2. Beijing Tongren Hospital Capital

Medical University, Beijing 100730, China)

【Abstract】ObjectiveTo improve the method of retinal vascular preparation and application in experimental animals of mice, rats, dogs and monkeys. Methods The retinal vessels were isolated with proteinase K-trypsin digestion technique. The samples were stained by hematoxylin-eosin(HE) and Periodic-Acid Schiff(PAS). The expression of CD31 and VEGF were detected by immunohistochemistry(IHC). ResultsThe spread sheets of vascular network are complete, and can clearly show the blood vessels. No nerve tissue residue is left. Different levels of vascular morphology are clear. The vascular branches are clear and complete with no fracture. The cell morphology is intact, and the cell nucleus is clearly dispayed. The entire process can be completed in a short time, and has a high success rate. The vascular antigen are successfully retained: Expression of CD31 can be seen in both pericytes and endothelial cells; VEGF is mainly expressed in endothelial cells. ConclusionsThe improved method is successfully applied in different experimental animals. This approach will provide an important contribution to the retinal vascular disease research.

【Key words】Retinal vascular preparation；Combined digestion；Antigen retrieval

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.005.012

【中圖分類號】R332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2015) 05-0051-04

[通訊作者]朱華(1971-),女，主任技師，研究方向：病理與病理生理學。E-mail： zhh@cnilas.org。

[作者簡介]徐玉環(1980-),女，初級技師。E-mail: yuhuanxu1109@163.com。

[基金項目]國家重點基礎研究發展計劃(973項目)(2011CB504903)。