兩品系小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn)結(jié)果比較

胡培麗，張露勇，李　波，邢書霞

(中國食品藥品檢定研究院，北京　100050)

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兩品系小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn)結(jié)果比較

胡培麗，張露勇，李波，邢書霞

(中國食品藥品檢定研究院，北京100050)

【摘要】目的分析比較BALB/c和CBA小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn)結(jié)果。 方法 將已知致敏性的4種化學(xué)物(2,4-二硝基氯苯、丁子香酚、己基肉桂醛和異丙醇)和未知致敏性的3種化妝品對BALB/c和CBA小鼠連續(xù)染毒3 d，第5天腹腔注射示蹤劑BrdU，第6天分離頜下淋巴結(jié)制取單細(xì)胞懸液，用ELISA試盒檢測細(xì)胞增殖。 結(jié)果 2,4-二硝基氯苯、丁子香酚、己基肉桂醛和3號燙發(fā)劑兩品系結(jié)果均呈致敏陽性，3種化學(xué)物EC1.6值分別為0.08%(極強(qiáng))、4.02%(中)、6.68%(中)(BALB/c)和0.07%(極強(qiáng))、6.08%(中)、8.89%(中)(CBA)；異丙醇、1和2號化妝品兩品系結(jié)果均為致敏陰性，SI均小于1.6。 結(jié)論 兩品系小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn)結(jié)果較一致，BALB/c可替代CBA小鼠應(yīng)用于化學(xué)物和化妝品的致敏性評價。

【關(guān)鍵詞】局部淋巴結(jié)試驗(yàn)；品系；化妝品

小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn)(local lymph node assay，LLNA)是皮膚致敏性多種替代方法中應(yīng)用最為廣泛的全球標(biāo)準(zhǔn)方法[1-3]，但該方法需要使用放射性標(biāo)記物、特定的設(shè)備和實(shí)驗(yàn)條件，不利于推廣；2010年OECD指南公布了基于摻入溴脫氧尿嘧啶核苷和酶聯(lián)免疫吸附測定的改良方法(LLNA:BrdU-ELISA)[4]，用示蹤劑替代放射性標(biāo)記物，較易推廣。該指南中推薦使用CBA小鼠，由于該品系小鼠在國內(nèi)供應(yīng)量較少，價格昂貴，給國內(nèi)很多學(xué)者開展該試驗(yàn)帶來了一定的困難。鑒于國內(nèi)外有使用BALB/c、NMRI、ICR、DBA/2、C57BL/6、SJL等品系的報(bào)道[5-10]，而BALB/c小鼠是國內(nèi)應(yīng)用較多的品系，遺傳穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)嘗試分析比較國內(nèi)BALB/c和CBA兩品系小鼠對LLNA:BrdU-ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，從而為LLNA實(shí)驗(yàn)選擇合適的動物品系提供參考。

1材料和方法

1.1受試物

溶劑由丙酮/橄欖油(AOO)(4∶1 v/v)配制而成，2,4-二硝基氯苯(DNCB)(中國醫(yī)藥總公司北京分公司)與異丙醇(IPA，北京化工廠)分別用AOO配成0.1% (w/v)、0.3% (w/v)、1.0% (w/v) 和25%(v/v)、50%(v/v)、100%(v/v)3個濃度；丁子香酚(EUG)與己基肉桂醛(HCA)均購自Sigma公司，均用AOO配成25%(v/v)、50%(v/v)2個濃度；3種化妝品原液直接涂抹于小鼠耳背皮膚。

1.2實(shí)驗(yàn)動物

SPF級BALB/c和CBA小鼠，雌性，8～10周齡，分別由中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動物資源中心和北京華阜康生物科技股份有限公司提供，合格證號分別為【SCXK(京)2009-0017】、【SCXK(京)2009-0004】。動物試驗(yàn)環(huán)境為中國食品藥品檢定研究院屏障系統(tǒng)動物房【SYXK(京)2011-0008】，溫度(22±2)℃，濕度50%～70%，動物自由飲食，12 h人工照明。

1.3試劑和儀器

BrdU粉劑與BrdU-ELISA試劑盒均購自德國Roche公司(編號10280879001、11647229001)。BrdU標(biāo)記液用生理鹽水配制成10 mg/mL。SYNERGY HT型全自動酶標(biāo)儀(美國BIO TEK 公司)、CR22G III型低溫離心機(jī)(日本HitacHi公司)。

1.4方法

1.4.1動物分組和染毒[4, 11]

動物隨機(jī)分為4只/組，4種化學(xué)物(己基肉桂醛、丁子香酚、2,4-二硝基氯苯、異丙醇)分別設(shè)為2～3個不同劑量組，共用一個AOO溶劑對照組；3種化妝品(1號精華霜、2號防曬霜、3號燙發(fā)劑)分別設(shè)一個最高劑量組，共用一個蒸餾水對照組。將受試物25 μL/耳/d涂抹于小鼠雙耳背部皮膚，連續(xù)涂抹3 d，對照組涂抹AOO或蒸餾水，第4天不處理，第5天腹腔注射BrdU標(biāo)記液0.5 mL，第6天處死動物分離頜下淋巴結(jié)。

1.4.2淋巴細(xì)胞制備[4, 11]

BrdU標(biāo)記液腹腔注射后24 h，處死動物，摘取頜下淋巴結(jié)，研磨后用不銹鋼篩網(wǎng)(200目)過濾制成單細(xì)胞懸液，PBS洗2次(離心1200 r/min，8 min)，每只小鼠的淋巴細(xì)胞定容于14 mL PBS中。

1.4.3ELISA檢測細(xì)胞增殖

將細(xì)胞懸液100 μL /孔加至96孔板中，離心(1400 r/min，10 min)，棄上清，吹干細(xì)胞。經(jīng)ELISA試劑盒處理后用酶標(biāo)儀檢測Brdu值(發(fā)射波長和參考波長分別為370 nm，492 nm)，BrdU標(biāo)記指數(shù)為(A370-A空白370)-(A492-A空白492)。

1.4.4SI、EC1.6值計(jì)算與致敏性分級

刺激指數(shù)( stimulation index，SI)=受試物組BrdU標(biāo)記指數(shù)均值/溶劑對照組BrdU標(biāo)記指數(shù)均值；SI≥1.6，并有劑量-效應(yīng)關(guān)系，該受試物為致敏陽性[4, 11]。根據(jù)SI計(jì)算EC1.6值和致敏級別，計(jì)算公式為[11]：①EC1.6=c+[(1.6-d)/(b-d)]×(a-c)(受試物各濃度組對應(yīng)SI值包括>1.6和<1.6)，②EC1.6=2^{log2(c)+[(1.6-d)/(b-d)]×[log2(a)-log2(c)]}(受試物各濃度組對應(yīng)SI值均>1.6)，其中設(shè)a、c為鄰近兩點(diǎn)受試物的濃度，b、d為對應(yīng)的SI值；當(dāng)SI=1.6時，其對應(yīng)的受試物濃度即為EC1.6值。分級標(biāo)準(zhǔn)為：EC1.6%<0.1極強(qiáng)，0.1≤EC1.6%<1.0強(qiáng)，1.0≤EC1.6%<10中,10≤EC1.6%<100弱[11]。

2結(jié)果

2.1染毒期間動物狀態(tài)觀察

染毒期間動物正常飲食，體重增長良好。部分組別(1% 2,4-二硝基氯苯)小鼠染毒部位出現(xiàn)水腫、紅斑或結(jié)痂刺激性或致敏性癥狀，各臟器未見有任何病變，未觀察到明顯的其他毒性癥狀。

2.2兩品系小鼠BrdU標(biāo)記指數(shù)和刺激指數(shù)SI值比較

由表1可見，BALB/c和CBA小鼠：AOO和蒸餾水對照組的BrdU標(biāo)記指數(shù)較一致，淋巴結(jié)增生程度均較低；3種已知致敏物(2,4-二硝基氯苯，丁子香酚和己基肉桂醛)各濃度SI均大于1.6，且均有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系；非致敏物異丙醇各濃度SI均小于1.6，與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]。1、2號化妝品SI均小于1.6，判斷為無致敏性，3號染發(fā)劑SI大于1.6，為致敏陽性。

表1　兩品系小鼠對4種化學(xué)物和3種化妝品LLNA:BrdU-ELISA測定結(jié)果

注：VS: 極強(qiáng)；M：中。

Note: VS: very strong; M: moderate.

2.3兩品系小鼠EC1.6值與致敏性分級比較

兩品系小鼠：2,4-二硝基氯苯EC1.6值較相近，為極強(qiáng)致敏物；丁子香酚和己基肉桂醛EC1.6值不是很一致，但均在1～10范圍內(nèi)，為中等強(qiáng)度致敏物(表1)。

3討論

由于實(shí)驗(yàn)動物的種屬、性別、年齡等差異影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此選擇合適的實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)尤為重要。OECD指南(TG429、TG442)推薦使用CBA雌性小鼠，給國內(nèi)各毒理實(shí)驗(yàn)室推廣該LLNA方法帶來了困難。BALB/c小鼠是國內(nèi)應(yīng)用較多的近交系，遺傳背景明確、穩(wěn)定，國內(nèi)外已有學(xué)者將BALB/c小鼠應(yīng)用于LLNA研究[5-10]，但目前國內(nèi)外關(guān)于該兩品系小鼠LLNA:BrdU-ELISA法評價化學(xué)物和化妝品致敏性的比較研究還未見相關(guān)報(bào)道。

本研究將BALB/c和CBA小鼠分別對不同致敏強(qiáng)度的4種化學(xué)物和3種化妝品進(jìn)行評價，結(jié)果兩品系對AOO和蒸餾水溶劑對照反應(yīng)均較低，對2,4-二硝基氯苯、丁子香酚和己基肉桂醛和3號燙發(fā)劑反應(yīng)均呈致敏陽性(SI>1.6)，且3種化學(xué)物劑量-反應(yīng)關(guān)系顯著；對異丙醇和1、2號化妝品反應(yīng)均呈致敏陰性(SI<1.6)。

從表1中我們可以發(fā)現(xiàn)CBA小鼠BrdU標(biāo)記指數(shù)和刺激指數(shù)SI值均偏高于BALB/c，推斷CBA小鼠較BALB/c表現(xiàn)出更高程度地BrdU攝取，但兩品系對4種化學(xué)物和3種化妝品的致敏性判斷一致，雖然2,4-二硝基氯苯、丁子香酚和己基肉桂醛的EC1.6值存在差異，但致敏強(qiáng)度分級均一致，表明該兩品系小鼠只是反應(yīng)程度有一定的差異，對化學(xué)物和化妝品致敏性判斷及致敏強(qiáng)度分級并無顯著影響。國際上也有學(xué)者將不同品系小鼠進(jìn)行了LLNA研究[5-6,12]，其結(jié)果與本研究一致。

綜上，BALB/c和CBA小鼠LLNA: BrdU-ELISA試驗(yàn)結(jié)果較一致，均可較好地評價化學(xué)物和化妝品的致敏性，BALB/c小鼠可替代CBA在國內(nèi)各毒理實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用于化妝品皮膚致敏性評價。

參考文獻(xiàn)：

[1]OECD.OECD guideline for the testing of chemicals skin sensitazation: local lymph node assay 429 [S/OL].2002. http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llnadocs/OECD 429.pdf.

[2]Boverhof DR, Gollapudi BB, Hotchkiss JA,etal. Evaluation of a toxicogenomic approach to the local lymph node assay (LLNA) [J]. Toxicol Sci, 2009, 107 (2): 427-439.

[3]Haseman JK, Strickland J, Allen D,etal. Safety assessment of allergic contact dermatitis hazards: an analysis supporting reduced animal use for the murine local lymph node assay [J]. Regul Toxicol Pharmacol. 2011, 59 (1):191-196.

[4]OECD.OECD guideline for the testing of chemicals skin sensitization: local lymph node assay: BrdU-ELISA [S/OL]. 2010.

http://ntp.niehs.nih.gov/iccvam/suppdocs/feddocs/oecd/oecd-tg442b.pdf.

[5]Woolhiser MR, Munson AE, Meade BJ. Comparison of mouse strain using the lymph node assay [J]. Toxicology, 2000, 146 (2-3): 221-227.

[6]Ehling G, Hecht M, Heusene A,etal. An European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: First round [J]. Toxicology, 2005, 212 (1): 60-68.

[7]劉協(xié)，呂中明，施偉慶，等．BALB/c和ICR小鼠用于局部淋巴結(jié)試驗(yàn)的研究[J]. 江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué), 2009, 20(1): 4-6.

[8]何國群，楊杏芬，鄭穗生，等. 溴脫氧尿嘧啶核苷摻入法作為皮膚致敏試驗(yàn)替代方法研究[J]. 中國職業(yè)醫(yī)學(xué), 2011,38(5): 377-380.

[9]陽曉燕，趙康峰，孔建，等. 局部淋巴結(jié)改良法在化妝品皮膚刺激性和致敏性檢測中的應(yīng)用[J]. 環(huán)境與健康雜志, 2013, 30 (4): 312-316.

[10]胡培麗，羅飛亞，陳志蓉，等. LLNA: BrdU-ELISA改良法的建立及其在化妝品安全性評價中的應(yīng)用[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 24 (9): 23-27.

[11]ICCVAM. Test Method Evaluation Report: The Murine Local Lymph Node Assay: BrdU-ELISA, a Nonradioactive Alternative Test Method to Assess the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals and Products [R]. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. NIH Publication, 2010. http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-ELISA/TMER.htm.

[12]Kimber I, Hilton J, Dearman RJ,etal. An international evaluation of the murine local lymph node assay and comparison of modified procedures [J]．Toxicology, 1996, 103 (1): 63-73.

〔修回日期〕2015-03-31

技術(shù)方法

The comparative study of two strains on results of Local lymph node assays

HU Pei-li，ZHANG Lu-yong，LI Bo，XING Shu-xia

(National Institutes for food and drug control，Beijing 100050，China)

【Abstract】ObjectiveTo analyze and compare results of local lymph node assays (LLNA) between BALB/c and CBA mice. Methods 4 chemicals (2,4-dinitrochlorobenzene, eugenol, hexyl cinnamic aldehyde and isopropanol) and 3 cosmetics were applied to the dorsum of both ears of Balb/c and CBA mice for three consecutive days. BrdU solution was injected inter-peritoneally on day 5. On day 6, the bilateral draining auricular lymph nodes were excised and made into single cell suspension, the lymph cell proliferation was measured by BrdU ELISA kit. Results2,4-dinitrochlorobenzene, eugenol, hexyl cinnamic aldehyde and NO.3 perm agent pretended positive for both strains, EC1.6 values of three chemicals were found to be 0.08% (very strong), 4.02% (moderate), 6.68% (moderate) and 0.07% (very strong), 6.08% (moderate), 8.89% (moderate) for BALB/c and CBA mice respectively. Isopropanol, NO.1 and NO.2 cosmetics pretended to be non-sensitizers with SI<1.6 for both strains. Conclusion This study showed that BALB/c mouse was essentially equal to CBA for LLNA: BrdU-ELISA, which suggested that BALB/c mouse was a good alternative for CBA used in chemicals and cosmetics allergenic evaluation.

【Key words】Local lymph node assay；Strain；Cosmetics

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.005.013

【中圖分類號】R758.22R332

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1671-7856(2015) 05-0054-04

[作者簡介]胡培麗(1981-)，女，碩士，助理研究員，研究方向：食品化妝品安全性評價，E-mail： hupeili-1981@163.com。

[基金項(xiàng)目]中檢院中青年基金項(xiàng)目(2013NC3)。