沉默FATE/BJ-HCC-2基因的表達對肝癌細胞遷移及侵襲的影響*

葛麗麗,樸軍顏,楊小昂#， 尹艷慧，張　毓

1)鄭州大學醫藥科學研究院 鄭州 450052　2)鄭州市兒童醫院檢驗科 鄭州 450053　3)北京大學免疫學系T細胞實驗室 北京 100083

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沉默FATE/BJ-HCC-2基因的表達對肝癌細胞遷移及侵襲的影響*

葛麗麗1,2),樸軍顏1),楊小昂1)#， 尹艷慧3)，張毓3)

1)鄭州大學醫藥科學研究院 鄭州 4500522)鄭州市兒童醫院檢驗科 鄭州 4500533)北京大學免疫學系T細胞實驗室 北京 100083

關鍵詞FATE/BJ-HCC-2；RNA干擾；肝癌；轉移

摘要目的：研究FATE/BJ-HCC-2基因表達與肝癌細胞遷移及侵襲的關系。方法：體外合成FATE/BJ-HCC-2基因序列特異性小干擾RNA(siRNA)，轉染肝癌細胞系克隆株5B4，并設非特異性siRNA轉染和空白對照組。采用RT-PCR及Western blot方法檢測各組細胞中 FATE/BJ-HCC-2 mRNA和蛋白的表達；通過Transwell小室模型檢測各組細胞體外遷移及侵襲的能力；激光共聚焦顯微鏡下觀察5B4及空質粒轉染的對照細胞(Mock)的骨架結構。結果：各組細胞中FATE/BJ-HCC-2 mRNA和蛋白表達差異有統計學意義(F=15.321，P=0.020)，特異性siRNA轉染組細胞低于其他2組(P<0.05)。抑制FATE/BJ-HCC-2基因表達后，細胞體外遷移及侵襲的能力降低(F=6.171和10.109，P<0.05)。5B4細胞形態拉長，蝌蚪狀，呈現遷移、游走的狀態；微絲豐富，形態規則，平行貫穿于細胞全長，細胞膜周圍有較多絲狀偽足伸出；微管減少，分布不規則。結論：FATE/BJ-HCC-2基因表達促進肝癌細胞的遷移及侵襲。

AbstractAim: To study the effects of FATE/BJ-HCC-2 gene expression on the migration and invasion of hepatocellular carcinoma(HCC) cells.Methods: The HCC cell clone line 5B4 cells was transfected with FATE/BJ-HCC-2 gene sequence-specific small interference RNA(siRNA) synthesised in vitro.The expressions of FATE/BJ-HCC-2 mRNA and protein were detected by RT-PCR and Western blot,respectively.The migration and invasion ability of cells were examined by Transwell assay. The cytoskeleton of 5B4 cells transfected FATE/BJ-HCC-2 and empty vector control(Mock) cells was observed by laser scanning confocal microscope.The 5B4 cells not treated were used as blank control.Results: Both of mRNA and protein expressions declined in the group of cells transfected with FATE/BJ-HCC-2 sequence-specific siRNA(F=15.321，P=0.020). The migration and invasion ability of 5B4 cells obviously reduced after FATE/BJ-HCC-2 gene was silenced (F=6.171 and 10.109，P<0.05). Compared with that of the mock cells, the morphological and cytoskeleton structure of 5B4 cells transfected with FATE/BJ-HCC-2 changed obviously. Conclusion: FATE/BJ-HCC-2 gene expression promotes migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells.

腫瘤-睪丸抗原是一類具有特異性表達模式的腫瘤相關抗原。正常情況下，腫瘤-睪丸抗原僅在睪丸的生殖細胞如精子、卵子和胎盤的滋養層細胞中表達。研究發現腫瘤-睪丸抗原在黑色素瘤等多種腫瘤組織中高表達，與腫瘤形成、腫瘤細胞凋亡、腫瘤細胞增殖與轉移等有密切關系，且能引起細胞和體液免疫應答，是目前臨床腫瘤免疫治療中最具有應用前景的一類腫瘤相關抗原。FATE/BJ-HCC-2是最近發現的新的腫瘤-睪丸抗原基因。該基因位于染色體Xq28，全長7 000 bp，共編碼含183個氨基酸的蛋白質[1]。在國際腫瘤-睪丸抗原分類中，FATE/BJ-HCC-2基因被命名為FATE/CT43[2]。作者前期的研究結果顯示，FATE/BJ-HCC-2 mRNA在肝癌組織中高表達，并與肝癌細胞的增殖以及肝癌組織的分化程度密切相關。該研究通過體外化學合成FATE/BJ-HCC-2序列特異性小干擾RNA(small interference,siRNA)，抑制肝癌細胞中FATE/BJ-HCC-2基因的表達，采用Transwell小室模型檢測細胞遷移及侵襲能力的改變，并在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞骨架的變化，進一步探討FATE/BJ-HCC-2 基因表達水平的變化對肝癌細胞遷移和侵襲的影響。

1材料與方法

1.1細胞和主要試劑穩定表達FATE/BJ-HCC-2的人肝癌細胞系7402的單克隆細胞株5B4和空載體轉染的Mock細胞由北京大學醫學部免疫學系T細胞實驗室建立并保存。DMEM培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司；LipofectamineTM2000 為Invitrogen 公司產品；抗-FATE/BJ-HCC-2多抗由北京大學醫學部免疫學系T細胞實驗室制備保存；羊抗兔HRP IgG抗體購自Zymed公司(北京中杉生物技術公司分裝)；DAB顯色劑購自北京中杉生物技術公司；總RNA提取試劑Trizol購自Gibco-BRL公司。dsRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成。

1.2細胞培養5B4細胞和Mock細胞均生長于DMEM培養基中，在37 ℃、體積分數5%CO2的條件下培養。取對數生長期細胞于轉染前1 d接種于6孔板，待細胞生長至50%～60%融合時，準備轉染。

1.3siRNA合成與細胞轉染根據GenBank 中FATE/BJ-HCC-2的序列，參考siRNA設計原則，設計FATE/BJ-HCC-2基因的siRNA。FATE/BJ-HCC-2特異性siRNA的正義鏈序列：5’-CCAAACGAGUU UGGAAUAUTT-3’,反義鏈序列：5’-AUAUUCCA AACUCGUUUGGTT-3’。為檢測siRNA的轉染效率，合成帶熒光標記的非特異性siRNA，正義鏈序列：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUCT-3’，反義鏈序列：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。250 μL無血清DMEM中加入20 μmol/L dsRNA 8 μL，室溫孵育5 min；另在250 μL無血清DMEM中加入LipofectamineTM2000 5 μL，室溫孵育5 min。將上述兩種溶液混勻，室溫孵育20 min,加入6孔板中，轉染48 h后收集細胞。

1.4RT-PCR檢測細胞中FATE/BJ-HCC-2 mRNA表達取轉染48 h后的5B4細胞，提取細胞總RNA，用紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度。取2 μg總RNA加入反轉錄酶處理，以反轉錄的cDNA為模板進行PCR擴增。內參GAPDH上游引物：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。FATE/BJ-HCC-2上游引物：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。PCR反應條件：94 ℃預變性 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，共30個循環;72 ℃ 延伸5 min。用2-ΔCT表示目的基因的表達量。

1.5Western blot檢測FATE/BJ-HCC-2蛋白表達取轉染48 h的細胞，用1×SDS裂解，提取細胞總蛋白。每個樣品上樣50 μg, 經SDS-PAGE電泳分離后，將蛋白轉移到PVDF膜上。10 g/L BSA 4 ℃封閉過夜，加入FATE/BJ-HCC-2抗體(稀釋5 000倍)，室溫孵育2 h，TBST漂洗3次，加入HRP標記的二抗(稀釋1 000倍)，4 ℃孵育1 h，TBST漂洗3次后顯影。

1.6細胞遷移及侵襲實驗 將含有趨化因子的無血清DMEM培養基按每孔600 μL加入Transwell實驗小室的底層，小心蓋上孔徑8 μm的聚碳酯膜。將消化好的空白對照(未作轉染)細胞和實驗組(特異性轉染組為轉染了FATE/BJ-HCC-2 siRNA的5B4細胞；非特異性轉染組為轉染了非特異性siRNA的5B4細胞)細胞按每孔2×105個加入上層小室，置于37 ℃、體積分數5% CO2培養箱中培養8 h后，吸棄上層小室培養基，用PBS濕潤的棉球小心擦去聚碳酯膜上面的細胞，取出聚碳酯膜，膜下面附著的即是遷移的細胞。將遷移的細胞用甲醇固定30 min，結晶紫染色20 min。每張聚碳酯膜隨機選擇5個視野，10倍鏡下計數遷移細胞。將50 μg ECM鋪在直徑8 μm的聚碳酯膜上，將細胞按每孔2×105個加入上層小室，培養10 h后，按照上述方法處理后計數侵襲到小室背面的細胞數。

1.7免疫熒光激光共聚焦實驗 取對數生長期的5B4和Mock細胞，接種于6孔板中，每組設3個復孔，培養板中預先植入高壓滅菌的蓋玻片，常規培養24 h。取出蓋玻片，PBS沖洗3次。40 g/L多聚甲醛室溫固定30 min, PBS沖洗3次，Triton X-100 通透15 min, PBS沖洗3次，用10 g/L的BSA室溫封閉1 h。將羅丹明標記的鬼筆環肽和FITC標記的β-tublin分別加入細胞中，室溫孵育1 h。PBS沖洗3次，加入hoechst33342避光染色30 min。PBS沖洗、瀝干，置于潔凈無熒光載玻片上，于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.8統計學處理應用SPSS 17.0 進行分析，各組細胞FATE/BJ-HCC-2 mRNA的表達和體外遷移及侵襲能力的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.15B4和Mock細胞中FATE/BJ-HCC-2基因的表達見圖1。

5B4細胞FATE/BJ-HCC-2 mRNA表達(1.000±0.102)高于Mock細胞(0.026±0.028)(t=17.600，P=0.003)。5B4細胞FATE/BJ-HCC-2蛋白表達高于Mock細胞。

2.2轉染后，各組細胞中FATE/BJ-HCC-2基因的表達FATE/BJ -HCC-2 mRNA的表達見表1，蛋白的表達見圖2。

表1　各組細胞FATE/BJ-HCC-2 mRNA的表達

F=15.321,P=0.020；*：與空白對照組和非特異性siRNA轉染組比較，P<0.05。

圖2　各組細胞FATE/BJ-HCC-2蛋白的表達

1：空白對照組；2：非特異性siRNA轉染組；3：特異性siRNA轉染組。

2.3各組細胞體外遷移及侵襲能力比較結果見表3。

表3　各組細胞的體外遷移和侵襲能力比較　個

*：與空白對照組和非特異性siRNA轉染組比較，P<0.05。

2.4細胞形態改變的觀察免疫熒光共聚焦顯微鏡下(圖3)可見，Mock細胞多呈不規則狀，形態較圓潤，易相連成片生長；微絲稀疏、紊亂；胞質內顯示豐富的微管組成的網狀結構，由細胞中心呈放射狀伸展到細胞邊緣，核周呈現較強的綠色熒光。5B4細胞形態拉長，蝌蚪狀，呈現遷移、游走的狀態；微絲豐富，形態規則，平行貫穿于細胞全長，細胞膜周圍有較多絲狀偽足伸出；微管減少，分布不規則，熒光弱。

圖3　細胞形態及細胞骨架觀察(標準尺=50 μm)

3討論

作者前期研究[3-5]顯示，FATE/BJ-HCC-2基因的表達與肝癌細胞的增殖呈正相關，而在肝癌組織中FATE/BJ-HCC-2蛋白的表達頻率為20%；部分患者外周血FATE/BJ-HCC-2 mRNA呈陽性表達。因此推測，FATE/BJ-HCC-2 可能在肝癌的發生、發展中發揮著重要作用。為進一步探索FATE/BJ-HCC-2的生物學功能，作者采用能夠穩定表達FATE/BJ-HCC-2基因的肝癌細胞株5B4細胞，觀察FATE/BJ-HCC-2基因表達變化后細胞形態的改變及該基因被沉默后肝癌細胞體外遷移和侵襲能力的變化。

腫瘤細胞的遷移及侵襲能力是其在體內轉移能力的體現。腫瘤細胞中存在多種促癌基因和抑癌基因，它們功能失調或者缺失從而導致腫瘤的形成、發展以及轉移[6-7]。惡性腫瘤轉移的形成過程包括侵襲、內滲、外滲和轉移4個部分。當腫瘤細胞失去細胞之間的黏附后,就會離開原發灶,滲入內皮血管進入體循環，最后定居于遠端位點從而完成腫瘤的轉移。腫瘤細胞的轉移是影響患者生活質量和死亡的主要原因，因此，探索腫瘤轉移的機制是拯救腫瘤患者的關鍵所在。近來研究[8]發現，上皮間質轉化(epithelia-l mesenchymal transitions,EMT)這一現象與腫瘤的發生、發展以及轉移密切相關。上皮間質轉化是腫瘤轉移的重要組織屏障。該研究結果顯示，干擾FATE/BJ-HCC-2基因表達后，肝癌細胞的遷移及侵襲能力明顯降低，提示FATE/BJ-HCC-2基因的表達與肝癌細胞的遷移及侵襲有密切聯系。

腫瘤細胞的侵襲和轉移與其運動能力密不可分，而細胞的有效運動一方面來自于細胞內、外的細胞因子對細胞骨架動力裝置所給予的原動力，另一方面則是骨架成分介導的黏附作用所提供的錨定力，兩者之間相互協調才能完成細胞的移動[9]。細胞骨架是由細胞中細纖維網狀物質組成的網架結構，直接影響細胞的結構和功能[10]。在細胞遷移過程中，細胞骨架前端伸出片狀或絲狀偽足，通過與細胞外基質建立新的黏附來維持伸展狀態；然后，細胞借助肌動蛋白、肌球蛋白來調節細胞體收縮，從而使細胞不斷向前運動；最后，細胞的尾部與基質部分分離，細胞回縮。由此可見，細胞的有效運動是腫瘤細胞遷移和侵襲能力的關鍵步驟[11-13]。因此，細胞骨架在腫瘤細胞的轉移和侵襲中起著非常重要的作用。該研究結果顯示，轉染了FATE/BJ-HCC-2基因的肝癌細胞的骨架結構發生明顯變化，細胞形態變得細長，蝌蚪狀，周圍有偽足，呈現遷移、游走的狀態。可見，FATE/BJ-HCC-2基因表達能夠改變肝癌細胞骨架結構，從而對促進肝癌細胞的遷移、侵襲及轉移能力具有一定的作用。

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*國家自然科學基金項目321400531010

Effects of silencing FATE/BJ-HCC-2 gene on migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells

GELili1,2),PIAOJunyan1),YANGXiaoang1),YINYanhui3),ZHANGYu3)

1)AcademyofMedicalandPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500522)ClinicalLaboratory,ZhengzhouChildren′sHospital,Zhengzhou4500533)DepartmentofImmunology,HealthSciencesCenter,PekingUniversity，Beijing100083

Key wordsFATE/BJ-HCC-2；RNA interference；liver cancer；metastasis

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.020

中圖分類號R735.7

通信作者#，男，1963年5月生，博士，研究員，研究方向：腫瘤免疫學，E-mail:xiaoangyang@163.com