人工干預對反復種植失敗患者著床窗口期子宮內膜組織中LPAR3和HOXA-11表達的影響*

趙　華，王興玲，李　麗， 李豫峰#

1)華中科技大學附屬同濟醫院生殖中心 武漢 430000　2)鄭州大學第三附屬醫院生殖中心 鄭州 450052

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人工干預對反復種植失敗患者著床窗口期子宮內膜組織中LPAR3和HOXA-11表達的影響*

趙華1)，王興玲2)，李麗2)， 李豫峰1)#

1)華中科技大學附屬同濟醫院生殖中心 武漢 4300002)鄭州大學第三附屬醫院生殖中心 鄭州 450052

關鍵詞子宮內膜容受性；子宮內膜搔刮術；同源框基因11；溶血磷脂酸受體3；調經促孕丸；反復種植失敗

摘要目的：探討對反復種植失敗(RIF)患者進行人工干預后，著床窗口期子宮內膜組織中溶血磷脂酸受體3(LPAR3)和同源框基因11(HOXA-11)表達變化對臨床結局的影響。方法：將92例因輸卵管因素不孕的RIF患者分為搔刮組(子宮內膜搔刮,n=31)、中成藥組(調經促孕丸，n=31)、未干預組(n=30)。采用RT-PCR和Western blot方法檢測3組患者窗口期子宮內膜組織中LPAR3和HOXA-11 mRNA和蛋白表達的情況，并觀察3組患者臨床妊娠率的差異。結果：搔刮組、中成藥組患者窗口期子宮內膜組織中LPAR3和HOXA-11 mRNA及蛋白表達量高于未干預組，差異有統計學意義(F=57.463和60.771，P<0.001；F=48.816和40.313，P<0.001)，而前兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。搔刮組、中成藥組復蘇周期臨床妊娠率分別是48.4%和32.3%，均高于未干預組(16.7%)，差異有統計學意義(χ2=6.908，P=0.032)，但前兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論：子宮內膜搔刮術和口服調經促孕丸2種干預措施均可以改善子宮內膜容受性，提高RIF患者的臨床妊娠率。

AbstractAim: To investigate the expressions and significance of LPAR3 and HOXA-11 in the mRNA and protein level at the endometrial implantation phase after the manual intervention in the patients with repeated implantation failure(RIF).Methods: According to the RIF patients′ willingness of receiving manual intervention and the different intervention methods, the 92 RIF patients with fallopian tube-related infertility were allocated into scratching group (n=31), Chinese patent medicine group (n=31) and non-intervention group (n=30).RT-PCR and Western blot were adopted to detect the expressions of LPAR3 and HOXA-11 mRNA and protein at the endometrial implantation phase after the ovulation of the RIF patients. Results: The results of RT-PCR and Western blot showed that the expressions of LPAR3 and HOXA-11 mRNA and protein in the scratching group and Chinese patent medicine group at the implantation window phase noticeably higher than those in the non-intervention group(F=57.463 and 60.771，P<0.001；F=48.816 and 40.313，P<0.001),however, there was no statistical difference between the former two groups. The clinical pregnancy rate(48.4%) in the scratching group and Chinese patent medicine group(32.3%) was higher than that in the non-intervention group(16.7%)(χ2=6.908, P<0.032),however, the comparison of the former 2 groups revealed no statistical difference (P>0.05).Conclusion: Two intervention measures, including the endometrial scratching and taking progestational pills, could improve the endometrial receptivity and enhance the clinical pregnancy rate of the RIF patients.

近年來，隨著輔助生殖技術水平的迅猛發展，胚胎的數量及質量都得以優化，但胚胎的植入率卻未得到明顯的提高。目前多數學者[1-2]把胚胎移植次數≥3次，或者優質胚胎移植數≥10個仍然未能達到臨床妊娠，視為胚胎反復種植失敗(repeated implantation failure，RIF)。此類患者排除其胚胎質量問題外，沒有其他明確的不孕因素，因此子宮內膜接受胚胎著床的能力下降可能是RIF的原因。如何預測并改善RIF患者子宮內膜容受性，從而提高再次助孕時的臨床妊娠率，已成為輔助生殖技術領域研究的熱點與難點。該課題組選擇2個已經公認的影響子宮內膜容受性的因子——溶血磷脂酸受體3(lysophosphatidic acid receptor 3，LPAR3)和同源框基因-11(hemeobox genes-11，HOXA-11)作為觀察指標，對RIF患者進行不同的臨床干預后，采用RT-PCR及Western blot方法檢測不同干預措施處理后2個因子在子宮內膜表達的差異及臨床妊娠結局，分析不同干預措施對臨床結局影響的可能機制，從而指導臨床選擇有效的干預方法，提高輔助生殖技術的臨床妊娠率。

1對象與方法

1.1研究對象選擇2013年9月至2014年1月在華中科技大學附屬同濟醫院生殖中心因輸卵管因素不孕行體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)助孕治療的患者92例，患者均采用標準長方案促排卵后有≥8枚優質胚胎[根據卵裂球對稱性和碎片的多少將卵裂期胚胎分為1級胚胎(胚胎卵裂球大小均勻，胞質碎片≤5%)和2級胚胎(胚胎卵裂球均勻或稍不均勻，5%<胞質碎片≤20%)，1級和2級胚胎均視為可移植的優質胚胎]，分別經過3次胚胎移植(<35歲移植2枚胚胎，≥35歲移植3枚胚胎)一直未孕，且至少還有2枚D3冷凍優質胚胎(凍胚)。患者還滿足如下納入標準：年齡<40歲；行優質胚胎移植≥3次，或移植多次優質胚胎累計≥10枚；近兩個月內無宮腔操作史，B超檢測子宮內膜無異常回聲；非子宮內膜異位癥患者；輸卵管無積水；夫妻雙方染色體正常，無活動期傳染病；3個月內無口服激素類藥物史。按行IVF-ET助孕干預措施的不同把RIF患者分為搔刮組(n=31)、中成藥組(n=31)和未干預組(n=30)。2種干預措施及黃體期內膜的獲取均在凍胚復蘇移植周期的前1或2個月經周期進行。該研究經醫院倫理委員會討論通過，充分尊重患者的醫療知情權和自主選擇權，在對患者行子宮內膜取材時，患者知情同意，并簽署知情同意書。

1.2干預措施①子宮內膜搔刮術：在凍胚移植前1個月經周期月經來潮6 h內對患者進行子宮內膜搔刮，用小號刮匙送到宮腔底部，輕柔、表淺并且均勻地搔刮子宮腔四壁內膜。②口服中成藥(調經促孕丸，審批號：211020027)：患者于月經周期第5天起口服調經促孕丸，早晚各1次，1丸/次(5 g/丸)，連服20 d(1個療程)，共用2個療程。

1.3子宮內膜的獲取納入該研究的所有患者均于凍胚移植前1個月經周期第10天監測排卵，排卵異常的患者采用促排卵的方法，兩者均于排卵后第5~7天，通過抽拉一次性子宮內膜取樣器Pipelle (江蘇“蘇云”醫療器械公司)的管芯吸取內膜組織，把吸出的少量內膜組織分成2份，分別放入一次性無菌試管中，封口并做標記,于-80 ℃液氮罐中保存。

1.4血清激素的測定月經周期的第2~4天及取子宮內膜的當天早晨，抽取患者空腹外周靜脈血3 mL，采用化學發光法檢測者血清激素水平。

1.5凍胚移植選擇細胞數≥6的1級和2級胚胎D3天凍胚進行復蘇移植。無論患者排卵是否正常、月經是否規律均采用人工周期建內膜進行凍胚解凍復蘇后移植。自月經周期第3天開始，口服戊酸雌二醇2～4 mg/d，每7 d 1次采用B超監測內膜厚度的變化；根據內膜厚度，戊酸雌二醇用量可增至6～8 mg/d；當內膜厚度≥8 mm時，肌內注射黃體酮60 mg/d(20 mg/支，浙江仙琚制藥公司)進行內膜轉化，注射黃體酮后第3天行胚胎移植。移植日開始口服達芙通(荷蘭蘇威制藥公司)20 mg/d進行黃體支持。胚胎移植后14～16 d抽取患者靜脈血檢測β-HCG水平，確定是否妊娠，于移植后第30～35天行陰道超聲檢查，確定是否臨床妊娠及著床孕囊數。

1.63組患者子宮內膜組織中LPAR3和HOXA-11 mRNA表達的RT-PCR檢測用Trizol液提取子宮內膜組織中的總RNA，反轉錄成cDNA。以β-actin為內參，取2 μL模板 cDNA 進行 PCR 擴增。引物序列及大小見表1。PCR反應體系：反轉錄產物2 μL，上、下游引物各2 μL，Easy Taq Buffer 5 μL，Easy Tap DNA 聚合酶 0.5 μL，dNTPs 4 μL，最后加超純水至反應體系總體積50 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環；72 ℃總延伸2 min。

表1　引物序列及大小

1.73組患者子宮內膜組織中LPAR3和HOXA-11 蛋白表達的Western blot檢測將解凍的20 mg內膜組織加入100~200 μL的裂解液直至充分裂解，14 000g離心5 min取上清。制膠跑電泳。將轉膜的硝酸纖維素膜放入封閉液中，37 ℃恒溫床上低速搖動封閉2 h。把一抗按11 000稀釋，4 ℃孵育過夜，按14 000稀釋二抗后覆膜37 ℃孵育45 min。最后將硝酸纖維素膜放入化學發光試劑中反應2 min，室溫晾干用于拍照，用Bandscan 5.0軟件進行灰度值分析。

1.8其他觀察指標比較3組患者的年齡、體重指數(body mass index，BMI)、不孕年限、新鮮周期基礎狀態(月經周期2~4 d)血清促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、促性腺激素(gonadotropin，Gn)天數、獲卵數、復蘇周期著床期(排卵后5~7 d)血清雌二醇(E2)、黃體酮(P)水平、胚胎移植數、移植日內膜厚度、妊娠率的差異。臨床妊娠：B超可探及宮內孕囊、胎芽及心管搏動；臨床妊娠率：臨床妊娠周期數/移植周期數×100%。

1.9統計學處理采用SPSS 17.0進行分析，應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較3組患者新鮮周期基礎情況、復蘇周期基礎情況、窗口期子宮內膜組織中LPAR3、HOXA-11 mRNA和蛋白表達的差異，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.13組患者新鮮周期基礎情況的比較見表2。

表2　3組患者新鮮周期基礎情況的比較

2.23組患者復蘇周期基礎情況的比較見表3。

表3　3組患者復蘇周期基礎情況的比較

2.33組患者窗口期子宮內膜組織中LPAR3、HOXA-11 mRNA和蛋白表達的比較見表4、圖1和2。

表4　3組患者窗口期子宮內膜組織中LPAR3、HOXA-11 mRNA和蛋白表達的比較

*：與搔刮組比較，P<0.05；#：與中成藥組比較，P<0.05。

圖1　3組患者窗口期子宮內膜組織中LPAR3、HOXA-11 mRNA表達的比較

圖2　3組患者窗口期子宮內膜組織中LPAR3、HOXA-11蛋白表達的比較

3討論

3.1LPAR3和HOXA-11在子宮內膜胚胎著床過程中的作用LPAR3是一種脂類小分子，在雌性嚙齒類動物生殖系統中具有多種功能，參與受精卵在子宮內的移行及胚胎植入子宮內膜的過程[1]；近年來研究[2]發現LPAR3基因敲除小鼠子宮內膜LPAR3 mRNA及其蛋白的表達與受精卵著床時間一致，并與子宮內膜著床期標志物胞飲突共同表達且同步消失，因此LPAR3可以作為小鼠內膜容受性的標志物。

HOXA-11是一類多基因家族的轉錄調節因子，Rackow等[3]發現不孕癥患者HOXA-11基因表達發生改變，從而導致胚胎著床率下降。還有學者[4-5]研究發現HOXA-11基因缺失的小鼠子宮體積縮小、內膜變薄、腺體減少、內膜血管直徑變小從而血流量減少，這表明HOXA-11基因的缺失或表達量的下降會導致子宮內膜發育障礙，從而導致胚泡著床率下降。

3.2子宮內膜搔刮術對子宮內膜容受性的影響子宮內膜搔刮術是一種機械局部刺激手段，臨床研究[6]發現在月經的早期輕刮子宮內膜各壁，可以改善RIF患者子宮內膜容受性，提高胚胎的植入率、臨床妊娠率和活產率，但其作用機制還不完全清楚，可能與促使子宮內膜發生蛻膜樣改變，有益于子宮內膜和胚胎種植之間的同步性，誘導著床窗口期的子宮內膜分泌多種有益于胚胎著床的細胞因子有關，其因子包括常見的白血病抑制因子、白細胞介素11等[7]，同時內膜搔刮可以去除內膜局灶性病變，如息肉、增生等病理改變。Raziel等[8]納入120例行卵胞漿內單精子顯微注射技術助孕的RIF患者進行子宮內膜搔刮術，其臨床妊娠率有明顯的提高。作者的研究顯示，內膜搔刮組LPAR3、HOXA-11 mRNA及其蛋白在著床窗口期子宮內膜的表達量明顯高于未干預組。RIF患者經過搔刮內膜干預后，其臨床妊娠率與未干預組患者比較明顯提高；兩干預組相比較，內膜搔刮組臨床妊娠率也高于中成藥組。作者的實驗結果顯示，內膜搔刮有益于提高RIF患者的臨床妊娠率；對行子宮內膜搔刮術的患者術后給予抗生素、止血劑，并在搔刮后第3天叮囑患者行超聲復查，因此內膜搔刮不會引起子宮內膜進一步的損傷，反而會增加內膜對胚胎的接受能力。

3.3中成藥對子宮內膜容受性的影響中醫學認為腎精、氣血和沖任直接參與胚胎著床的過程。張敏等[9]認為根據患者的不同情況合理對癥地應用中藥，不僅可以促進不孕患者排卵，同時改善子宮內膜容受性，提高妊娠率。中藥方主要以補腎益氣、調理氣血等特性治療不孕癥，收到了良好的臨床效果。該研究選取調經促孕丸對RIF患者進行干預性治療，該中成藥由續斷、鹿茸(去毛)等18味中草藥組成，諸藥配合，共奏補腎健脾、養血調經之功，改善患者子宮內膜下血流及內膜微環境，從而達到提高子宮內膜容受性的目的。該研究結果顯示，中成藥組LPAR3、HOXA-11 mRNA和蛋白在著床窗口期子宮內膜的表達量明顯高于未干預組，低于內膜搔刮組。中成藥組臨床妊娠率明顯高于未干預組，低于搔刮組；結果表明調經促孕丸可以改善RIF患者的臨床結局。黃青蘭[10]應用調經促孕丸治療278例不孕患者取得滿意的療效，作者的研究結果與之相符。

總之，內膜搔刮術在RIF患者的臨床治療中具有較好療效，而口服中成藥調經促孕丸是一種安全、有效、副作用小、能改善內膜微環境的干預措施。但該研究樣本量較小，尚需擴大臨床樣本量，進一步明確內膜搔刮術、口服中成藥提高內膜容受性的作用機制，從而為其大規模的臨床應用提供理論依據。

參考文獻

[1]Ye X,Herr DR,Diao H,et al.Unique uterine localization and regulation may differentiate LPA3 from other lysophospholipid receptors for its role in embryo implantation[J].Fertil Steril,2011,95(6):2107

[2]Sordelli MS,Beltrame JS,Cella M,et al.Interaction between lysophosphatidic acid, prostaglandins and the endocannabinoid system during the window of implantation in the rat uterus[J].PLoS One,2012,7(9):e46059

[3]Rackow BW,Jorgensen E,Taylor HS.Endometrial polyps affect uterine receptivity[J].Fertil Steril,2011,95(8):2690

[4]Alizadeh Z,Faramarzi S,Saidijam M,et al.Effect of intramural myomectomy on endometrial HOXA10 and HOXA-11 mRNA expression at the time of implantation window[J].Iran J Reprod Med, 2013,11(12):983

[5]Varlakhanova N,Cotterman R,Bradnam K,et al.Myc and Miz-1 have coordinate genomic functions including targeting Hox genes in human embryonic stem cells[J].Epigenetics Chromatin,2011,4(4):20

[6]Wise J.Endometrial scratching improves IVF pregnancy rate[J].BMJ,2013,347(1):f6007

[7]Kalma Y,Granot I,Gnainsky Y,et al.Endometrial biopsy-induced gene modulation: first evidence for the expression of bladder-transmembranal uroplakin Ib in human endometrium[J].Fertil Steril,2009,91(4):1042

[8]Raziel A,Schachter M,Strassburger D,et al.Favorable influence of local injury to the endometrium in intracytoplasmic sperm injection patients with high-order implantation failure[J].Fertil Steril,2007,87(1):198

[9]張敏,齊聰,張勤華.溫腎活血湯聯合克羅米芬改善促排卵子宮內膜容受性療效研究[J].生殖與避孕,2010,30(9):601

[10]黃青蘭.調經促孕丸治療不孕癥278例療效觀察[J].中國醫藥指南,2011,9(16):325

*國家自然科學基金資助項目81273712

Influence of manual intervention on LPAR3 and HOXA-11 expressions at the endometrial implantation period in RIF patients

ZHAOHua1)，WANGXingling2)，LILi2)，LIYufeng1)

1)TheReproductionCenter,TongjiHospital,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan4300002)TheReproductionCenter,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsuterine endometrial receptivity;uterine endometrial scratching;HOXA-11;LPAR3;progestational pill;repeated implantation failure

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.022

中圖分類號R711

通信作者#，男，1964年6月生，博士，主任醫師，研究方向：生殖醫學， E-mail:Yufengli64@tjh.tjmu.edu.cn