葡萄籽原華青素對慢性間歇性低氧大鼠空間工作記憶和5-羥色胺的影響

喬　嬌　趙雅寧　李建民

(河北聯合大學康復醫學院 ，河北　唐山　063000)

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葡萄籽原華青素對慢性間歇性低氧大鼠空間工作記憶和5-羥色胺的影響

喬嬌1趙雅寧李建民

(河北聯合大學康復醫學院 ，河北唐山063000)

摘要〔〕目的探討葡萄籽原華青素(GSP)對慢性間歇性大鼠空間工作記憶和5-羥色胺(5-HT)的影響。方法80只健康雄性SD大鼠隨機分為：對照組、模型組、GSP低劑量組(100 mg/kg)、GSP高劑量組(200 mg/kg)，每組20只。對照組暴露于空氣中，模型組暴露于低氧條件下(50 ml/L)，暴露時間每天8 h，持續4 、8 w；應用HE染色觀察腦組織形態變化；Morris水迷宮檢測大鼠的空間記憶能力；用高效液相色譜法測定損傷大腦皮質內5-HT的含量。結果與對照組比較，模型組皮質區存活神經細胞數量減少，5-HT的含量明顯降低(P<0.05)；水迷宮測試結果顯示動物潛伏期明顯延長，穿臺次數明顯減少(P<0.05)。與模型組比較，GSP組皮質區存活神經細胞數量增多，5-HT的含量明顯增多，水迷宮檢測動物逃避潛伏期時間縮短、穿臺次數增多(P<0.05)；上述變化在高劑量GSP組最為顯著(P<0.05)。結論GSP可增加5-HT的含量、改善間歇性低氧大鼠空間工作記憶能力。

關鍵詞〔〕葡萄籽原華青素；間歇性低氧；5-羥色胺；空間工作記憶

1四川省婦幼保健院

第一作者：喬嬌(1982-)，女，護師，碩士，主要從事急危重癥護理學和護理教育研究。

工作記憶是指大腦對信息進行短暫儲存及加工處理的過程；空間記憶是工作記憶的一種，是日常生活中最為重要的認知功能之一，能幫助個體對周圍環境中的物體進行定位或是學習路線〔1〕。阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS) 可造成患者記憶障礙以及出現執行能力和運動協調方面的認知問題〔2，3〕。5-羥色胺(5-HT)是腦內重要的神經遞質，與許多功能調節有關，諸如睡眠、性行為、情感行為以及學習和記憶等〔4〕。原花青素(GSP)是天然植物中廣泛存在的一大類多酚類化合物的總稱，以葡萄籽中含量最為豐富。研究表明葡萄籽原花青素(GSP)具有抗氧化、清除自由基、心血管保護、降血脂、抗腫瘤等功能〔5，6〕，但目前有關GSP對睡眠呼吸暫停造成工作記憶的研究，少見報道。本研究采用濃度結合時間切換的方式模擬臨床睡眠呼吸暫停狀態的低氧，建立慢性間歇性缺氧模型，探討GSP對間歇性低氧大鼠空間記憶與5-HT的影響。

1材料和方法

1.1實驗動物、試劑及儀器雄性SD大鼠80只(中國醫學科學院實驗動物研究所動物資源中心提供，實驗動物合格證編號：0127011)，體質量210～230 g；測氧儀(建德市梅城電化分析儀器廠)；低氧控制程序(河北聯合大學醫院呼吸科)；純氮(唐山六方氣體高科技有限公司)；低氧艙(天津醫科大學研制)。GSP由天津市尖峰天然產物研究開發有限公司提供；SABC試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2動物分組和模型制備80只雄性SD大鼠隨機分成對照組、模型組，高、低劑量GSP干預組，每組20只。模型組：模擬臨床呼吸暫停事件，建立OSAHS模式間歇低氧動物模型：每天8：00am～4：00pm將實驗動物置于模型艙內，向艙內循環充入氮氣和空氣，每次循環2 min，連續給予氮氣30 s，維持艙內氧濃度最低至5%(50 ml/L)，隨后均復氧至氧濃度21%(210 ml/L)。對照組持續充入壓縮空氣。用數字測氧儀監測艙內氧濃度變化，使艙內氧濃度維持在各自的氧濃度內，使其氧濃度波動范圍在±0.5%以內；每天實驗8 h，實驗持續時間為2 w和6 w。GSP組在動物進入低氧模型艙前2 w開始每天灌胃給藥1次，持續給藥8 w，高、低劑量分別為200、100 mg/kg。對照組暴露于正常空氣中；分別在實驗第2周和第6周進行所設指標檢測。

1.3腦組織形態結構觀察病理組織學檢測各時間點4%多聚甲醛灌注固定后取腦，截取視交叉平面至大腦橫裂腦組織，常規石蠟包埋。Leica石蠟切片機連續冠狀切片，片厚5 μm，蘇木伊紅染色(HE)染色。在有測微尺的光學顯微鏡(200×)下觀察額葉皮質區神經元形態變化并計數該視野下的存活神經元數量(有明顯細胞膜、細胞核、核仁為存活神經細胞)。具體方法：將每個標本取4張切片，在額葉皮質區隨機選取4個視野，在有測微尺的光學顯微鏡(200×)下觀察額葉皮質區陽性細胞變化并計數(200×)倍視野下的陽性細胞數量，以每個視野下平均細胞百分率(200×下皮質區存活細胞數量與總細胞數量比值%)表示。

1.4色譜柱檢測腦內5-HTHPLC Column C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，保護柱DIKMA(4 mm×8 mm，5 μm)。柱溫20℃，流動相選用檸檬酸、檸檬酸三鈉、甲醇-離子對試劑-EDTA-Na2混合液(pH4.2)，經過濾后梯度洗脫。取凍存大鼠腦皮層準確稱重，用預冷的高氯酸(內含0.15 μg/ml的DHBA)制備10%的組織勻漿，離心15 min，上清液過濾后取10 μl手動進樣，在上述色譜條件下，采用內標法測定5-HT含量以ng/g腦組織濕重表示，樣本處理液：0.01%半胱氨酸+0.2 mol/L高氯酸鈉+0.5 mmol/L EDTA。

1.5記憶功能檢測Morris水迷宮是目前國內外研究中廣泛應用的檢測空間學習記憶功能最精確、客觀的一種方法。實驗時，將安全島置于水迷宮第二象限中，加水至高過安全島2～3 cm，水溫保持在22℃～25℃，由攝像機及計算機自動跟蹤、拍攝和統計大鼠分別由四個象限入水后尋找到安全島的軌跡、潛伏值和穿臺次數。如在90 s內未找到安全島，則潛伏期值記為90 s。在規定時間點處死前晨起訓練5次后，分別在上午、下午各測試3次，共6次納入統計，記錄各組大鼠逃避潛伏期時間及撤去平臺后動物穿越原平臺位置的次數，取總均值。

2結果

2.1GSP對慢性間歇性低氧大鼠空間記憶能力的影響與對照組相比，模型組動物的大鼠逃避潛伏期時間均延長、穿越原平臺位置的次數均減少；與模型組組比較，GSP組能顯著縮短大鼠逃避潛伏期時間、增加原平臺位置的次數(P<0.05)。見圖1，表1。

2.2GSP對慢性間歇性低氧大鼠皮質區神經細胞形態結構的影響對照組大鼠大腦皮層結構完整，細胞排列整齊。模型組大鼠在間歇性低氧2 w、6 w均可見變性壞死的神經元，神經細胞胞體收縮呈三角形，胞質嗜色性減弱，核皺縮濃染，細胞周圍出現空隙；視野內可見有核溶解及神經元細胞空泡樣變，細胞間隙顯著增寬，存活神經元密度均明顯減少(P<0.05)；GSP組中皮質區神經元結構損傷減輕，大部分細胞結構完整，存活神經元細胞存活密度顯著增加(P<0.05)。見圖2。

2.3GSP對慢性間歇性低氧腦組織5-HT含量的影響與對照組相比，模型組大鼠腦皮質中5-HT含量顯著降低(P<0.05)。與模型組相比較，GSP組中腦組織5-HT含量都有不同程度升高(P<0.05)。見表2。

圖1各組大鼠空間記憶能力表

組別逃避潛伏期(s)2w6w穿臺次數2w6w對照組12.65±2.5512.21±2.6011.57±2.1810.94±2.40模型組36.84±11.351)44.20±4.661)4.62±1.251)3.10±0.921)低劑量GSP組28.93±9.481)2)36.04±4.951)2)5.81±1.601)2)6.32±1.121)2)高劑量GSP組20.76±2.021)2)3)22.86±3.181)2)3)7.68±1.611)2)3)9.22±1.181)2)3)

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.05；與低劑量GSP組比較：3)P<0.05，下表同

圖2各組大鼠6 w后皮質區神經元形態變化(HE，×400)

組別存活神經元密度(%)2w6w含量5-HT(ng/g)2w6w對照組99.4±0.699.2±0.844.2±8.5542.65±10.49模型組63.5±22.71)54.7±33.81)28.27±4.861)22.67±4.321)低劑量GSP組74.4±21.81)2)62.2±20.61)2)33.78±5.971)2)30.69±5.261)2)高劑量GSP組82.5±17.21)2)3)74.7±19.41)2)3)47.93±7.791)2)3)38.43±5.531)2)3)高劑量GSP組20.76±2.021)2)3)22.86±3.181)2)3)7.68±1.611)2)3)9.22±1.181)2)3)

3討論

工作記憶包括負責加工位置、距離等空間信息的視空間模板和處理語音方面的信息語音環路以及中央執行系統，其核心是系統位于前額葉〔7〕。神經影像學顯示OSAHS患者大腦的多個部位和功能區受損如大腦皮質灰質丟失，海馬區在內的腦實質萎縮等；應用事件相關電位事件評測睡眠呼吸暫停患者，發現反應信息加工事件電位N270電位(前額及枕部)波幅降低，患者工作記憶降低〔8，9〕。本研究結果顯示GSP可改善睡眠呼吸暫停模式低氧導致的工作記憶損傷。研究認為睡眠呼吸暫停造成的間歇性低氧類似于缺血再灌注，可造成腦內生成大量氧自由基，導致神經細胞結構損傷、丟失，引起記憶功能損害〔10〕；而GSP抗氧化能力極強，是維生素E(VitE)的50倍、VitC的20倍，與SOD相當〔11〕，因此可改善睡眠呼吸暫停大鼠記憶能力，能增強其信息的獲取、加工及保持能力。

5-HT是腦內存在的一種重要的神經遞質，對記憶的調節以及腦功能的維持有重要作用。Mazer等〔12〕給成年大鼠腦中灌注酪氨酸羥化酶抑制劑-對氯苯丙氨酸以耗竭5-HT，結果出現大鼠學習能力缺損。學習記憶能力下降的大鼠其腦內5-HT亦顯著降低〔13〕。研究發現迷迭香對血管性癡呆大鼠學習記憶功能有改善作用；且這種作用與腦內5-HT的改變有關〔14〕。目前臨床資料已經證實睡眠呼吸暫停患者體內5-HT水平發生變化，且這種變化與病情的嚴重程度相關〔15〕。本研究發現隨間歇性低氧時間的延長，動物腦內5-HT的含量降低，說明5-HT參與睡眠呼吸暫停模式間歇性低氧對中樞神經系統的病理進程。研究認為〔16〕睡眠呼吸暫停模式的間歇缺氧造成的反復缺氧后再復氧，可引起神經細胞能量代謝障礙、氧自由基損傷，導致單胺類神經遞質5-HT等合成和攝取，釋放紊亂，腦實質神經細胞內5-HT降低。本研究中，給予GSP干預后，5-HT明顯改善，其表達水平呈劑量依賴式顯著增加，說明GSP對睡眠呼吸暫停間歇性低氧大鼠腦內5-HT水平有一定調節作用。這可能是GSP對OSAHS致工作記憶損傷的機制之一。

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〔2014-08-07修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

《中國老年學雜志》被國際數家數據庫、檢索性期刊檢索機構收錄情況

根據國際檢索機構給中國科學技術期刊編輯學會國際交流工作委員會、中國高等學校自然科學學報研究會對外聯絡委員會發來的電子郵件及其附件統計整理, 《中國老年學雜志》2009年又被4種國際重要檢索系統列為來源期刊:

1)美國化學文摘(CA)，CODEN ZLZHAO，http://www.lib.dlut.edu.cn/layersec.asp；

2)波蘭《哥白尼索引》(IC, Index of Copernicus), http://journals.indexcopernicus. com/karta. Php;

3)日本《科學技術社(中國文獻數據庫)》(JST, Japan Science & Technology Agency) (Chinese Bibliographic Database);

4)美國《烏利希期刊指南》(UPD,Ulrich′s Periodicals Directory), http://www. ulrichsweb. com/ ulrichsweb/;

5)美國《劍橋科學文摘：生物科學》(CSA：BS)。

通訊作者：趙雅寧(1974-)，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事老年病學研究。

基金項目：河北省教育廳重點資助項目(No.ZH2012046)

中圖分類號〔〕R364.4〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6722-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.034