全基因組測序在細菌耐藥性分析中的應用

李 秀，強 斌，徐正中，孟 闖，陳 祥，焦新安

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全基因組測序在細菌耐藥性分析中的應用

李 秀，強 斌，徐正中，孟 闖，陳 祥，焦新安

細菌耐藥性特別是多重耐藥性已經成為全球共同關注的問題，其嚴重威脅疾病的治療，并造成巨大的經濟損失。傳統的耐藥性分析方法耗時耗力，全基因組測序作為一種新型技術，可能會成為一種簡單、快速和高效的耐藥性分析方法，且具有較好的敏感性和特異性。除了在已知耐藥基因型確定和耐藥表型預測外，該方法還可發現新的潛在的耐藥基因。現對全基因組測序在細菌耐藥性中的應用作一綜述。

耐藥性；全基因組測序；耐藥基因

細菌的耐藥性問題在抗菌藥物應用初期就受到關注。20世紀40年代青霉素開始應用于臨床，幾乎在同一時期就發現青霉素酶的存在，細菌的耐藥性問題開始出現[1]。抗菌藥物僅僅使用70多年，很多曾經可以輕易治療的細菌感染疾病現在已經很難治療。當前，全球細菌耐藥性問題仍以驚人的速度在加劇，但幾乎沒有成功用于治療的新藥物產生，很多曾經可以用一種藥物治療的傳染病目前已經成為嚴重的公共衛生安全問題[2]。耐藥性，特別是多重耐藥菌株的不斷出現，給人和動物疾病的治療帶來極大的困難[3]。

目前，常用的耐藥性研究方法主要從基因型和表型兩方面進行。PCR是常用的基因型檢測方法，主要用于檢測已知的耐藥基因及其突變情況。藥物敏感性試驗作為表型檢測方法，只能檢測有限的抗菌藥物，且耗時耗力，尤其是某些需要特殊生長環境的細菌[4]。這些傳統的分析方法能幫助我們掌握細菌耐藥情況，但各有其受限之處。

基因組包含生物體的全部遺傳信息，基因組測序技術能夠直接反映基因組DNA的遺傳信息，不僅為基礎研究提供重要信息，也對基因組研究、藥物研發和基因治療等領域產生巨大的推動作用。

1 全基因組測序技術的發展

自上世紀70年代中期第一代DNA測序技術出現，至今已發展出第3代測序技術，30多年期間DNA測序技術已經取得了相當大的進展。

第1代測序技術成本高、速度慢，并不是理想的測序技術，目前采用的主要是2代測序技術，其以高通量、低成本為重要特征，主要包括Roche公司的454測序技術[5]，Illumina公司的Solexa測序技術[6]和ABI公司的SOLiD測序技術[7]。Roche 454技術和Solexa技術是聚合酶合成測序法，SOLiD則是連接酶合成測序法。第2代測序技術雖然在各方面都取得了較大的進展，但由于其是建立在PCR基礎上，仍會帶來偏差[8]。

目前最新的第3代測序技術是單分子實時測序。Helicos公司推出的遺傳信息分析系統(Heliscope/ helicos Genetic Analysis System)[9]、Pacific Biosciences公司推出的SMRT技術和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子技術[10]，標志著第3代測序技術的誕生。與前兩代測序技術相比，3代測序技術的成本大大降低。

2 全基因組測序在耐藥性分析中的應用

過去十年，測序技術的發展使臨床微生物學有了革命性的進展。近來研究表明，全基因組測序分析可能在細菌耐藥基因型確定和預測耐藥表型中成為一種簡單、快速和高效的方法，并且有較高的敏感性和特異性[4]，這使得可培養微生物的耐藥性分析實現了“一步法”，且分析周期短于1 d[11]。

2.1 在革蘭陰性菌耐藥性分析中的應用 Stoesser等[11]利用Illumina HiSeq2000對74株大腸桿菌(Escherichiacoli)和69株肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)進行全基因組測序，分析其對阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、頭孢曲松、頭孢他啶、環丙沙星、慶大霉素和美羅培南7種常見抗菌藥物的耐藥性。將全基因組測序數據用基于BLASTn的方法與包含染色體和質粒的多于100個已知耐藥基因的基因庫進行比較預測，并與肉湯稀釋法得到的表型結果進行比較，結果顯示敏感性為0.96(95%CI: 0.94-0.98)，特異性為0.97(95%CI: 0.95-0.98)，并且得到一系列的耐藥基因：blaCTX-M、blaLEN、blaOKP、blaOXA、blaSHV、blaTEM、aac(3′)-Ia、aac-(3′)-IId、aac-(3′)-IIe、aac(6′)-Ib-cr、aadA1a、aadA4、aadA5、aadA16、aph(6′)-Id、aph(3′)-Ia、qnrB、qnrS以及染色體上喹諾酮耐藥決定區域基因gyrA和parC。

Sima等[12]也利用全基因組測序技術對一株來自黎巴嫩病人的產超廣譜β-內酰胺酶肺炎克雷伯氏菌進行測序分析，并利用RAST在線注釋服務器進行自動注釋。結果顯示該菌株含有不同的β-內酰胺類耐藥基因，包括blaOXA-1、blaCTX-M-15、blaSHV-11和blaTEM-1b。此外，該菌株中還檢測到其它共存基因，其中最值得關注的是acc(6′)-lb-cr和qnrb1。

Teresa等[13]利用全基因組測序技術對一株多重耐藥的海藻希瓦菌(Shewanellaalgae)MARS14的耐藥基因組(resistome)和毒力因子進行分析。該菌株對阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸和頭孢西丁表現耐藥，序列分析顯示該菌含有ampC和blaOXA-55基因。雖然該菌株對氟喹諾酮類藥物(如環丙沙星)表現敏感，但含有qnr4基因。此外，該菌株基因組中還分析得到15種耐藥結節分化外排泵、3種多重耐藥外排蛋白家族和80種ABC結合超家族。

Zhao等[4]則利用全基因組測序技術對82株空腸彎曲桿菌和32株結腸彎曲桿菌(Campylobacterspp)的耐藥基因型進行預測，并評價其與藥物敏感性試驗得到的耐藥表型之間的相關性。結果顯示，其中108株四環素耐藥菌株全部含有tetO基因，敏感菌株則不含該基因，基因型與表型符合率為100%。同樣，萘啶酸/環丙沙星的符合率也為100%。在78株對慶大霉素耐藥菌株中，76株含有aac(6′)-Ie/aph(2″)-Ia、aac(6′)-Ie/aph(2″)-If、aph(2″)-Ib、aph(2″)-Ic、aph(2″)-Ig、aph(2″)-If或aph(2″)-Ih基因中的一個，1株含有aph(2″)-If和aac(6′)-Ie/aph(2″)-Ia2個耐藥基因。耐藥菌株的基因型和表型符合率為98.7%(77/78)，而其敏感性菌株的符合率為100%。當然，也存在其它一些基因型和表型符合率存在差異的情況，如阿奇霉素、克林霉素和泰利霉素。全部菌株基因型和表型的總符合率高達99.2%(1 018/1 026)。

除了常見的革蘭氏陰性菌，2015年Nandagopal等[14]對一株來自人血液，表現多重耐藥的銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)VRFPA09進行測序，發現該菌株含有編碼β-內酰胺酶的基因blaVEB-1、blaOXA-10及多重耐藥和毒力因子的相關基因。對于已經確定的基因型而言，全基因組測序技術具備直接確定基因型并預測耐藥表型的功能。

2.2 在革蘭陽性菌耐藥性分析中的應用 全基因組測序技術在革蘭陽性菌耐藥性分析中的應用主要集中在結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)。WHO將清除結核病的時間定在2035年，而結核分枝桿菌的多重耐藥性是完成此目標的最大障礙[15]。利用全基因組測序不僅能夠篩選到已知的耐藥相關基因簇，還可用來確認潛在性或者未知的基因簇[16]。Timothy等[15]對2 099株結核分枝桿菌的基因組進行了測序，將23個耐藥基因作為候選基因，并從算法上將基因突變分為非耐藥因子、耐藥因子以及未確認因子，評估其預測1 552個獨立候選基因組的藥物敏感性表型的能力，用于尋找在相似選擇壓力下除已知耐藥因子以外的突變候選基因，從而來解釋其余的未解耐藥表型。結果確認了120個突變為耐藥因子和722個為非耐藥因子，其中89.2%的確認表型可以被預測，敏感性和特異性分別為92.3%(95% CI: 90.7-93.7)和98.4%(95% CI: 98.1-98.7)；另外10.8%的表型無法被預測，主要是由于出現未知的突變。大量已知的基因突變使得全基因組測序數據可以在臨床中預測耐藥或敏感，或者確認不能通過基因型預測的表型。這種方法可以替代藥物敏感性試驗，并已被應用到常規的診斷過程中以便更快地獲取耐藥表型。如英國公共衛生組織已將全基因組測序技術作為“一步法”診斷分枝桿菌感染的可能性。全基因組測序在多重耐藥的結核病上具備實現“個體化”治療的潛在可能[17]。Keira等[18]利用全基因組測序對來自夸祖魯-納塔爾的337株臨床菌株進行分析，以確認結核病的普遍耐藥性是最近產生的還是逐漸演化而來。在我國，Zhang等[19]也對一株來自江蘇無錫的多重耐藥北京/W型結核分枝桿菌(W146)進行測序，該菌株包含幾乎所有耐藥性關基因及其突變，如rpoB(S531L)、rpsL(K43R)、gidB(E92D)、embB(M306I)以及gyrA基因等。

結核分枝桿菌復合群的全基因組測序數據表明許多地區的結核分枝桿菌突變體具有區域性特征[20]，表明對耐藥基因突變進行分類至關重要。目前常用的基于PCR的分類方法需要大量重復性工作，費時費力，并且分辨率較低，無法區分親緣關系較近的結核分枝桿菌。Hiroki等[21]建立一種基于SNP(single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態性)串聯體的針對結核桿菌的在線服務器，CASTB(comprehensive analysis server for theMycobacteriumtuberculosiscomplex，結核分枝桿菌復合群綜合分析服務器)，可用于流行病學分析、耐藥性預測和系統進化分析(http://castb.ri.ncgm.go.jp/CASTB/index.html)。Francesc等[22]則建立了針對15種抗菌藥物，包含1 325個突變體的預測性基因庫，其中11種抗菌藥物已經被792株菌株的全基因組測序數據證明，同時 “TB-Profiler”在線方法也證明該基因庫優于其它常規診斷方法和其他已建立的耐藥基因庫。

除了在結核分枝桿菌中研究較為廣泛，全基因組測序技術也在其它革蘭陽性菌株中得到應用。如Kok-Gan等[23]對一株來自慢性阻塞性肺炎病人的溶血性葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)C10A進行了測序，并利用未加工的基因組序列發現其潛在的多重耐藥因子和毒力因子，該菌株包含針對氨基糖苷類、大環內酯類、喹諾酮類、青霉素類、四環素類和糖肽類藥物的多種耐藥因子。

3 小 結

隨著DNA測序技術的迅速發展，其已經在流行病學診斷和藥物敏感性預測等方面得到廣泛應用，研究對象也由簡單的單個或幾個基因及其作用轉為全基因組的結構和功能。由于耐藥性自身及受到環境等外界因素影響的復雜性，傳統研究方法已無法滿足要求。全基因組測序技術能夠分析得到耐藥基因及其突變情況，除了已知的耐藥機制，還可用于預測未知的潛在耐藥機制，耐藥基因的表達決定著細菌耐藥性，因此該方法可以更好地為解決耐藥性問題提供重要參考，全基因組測序技術未來可能超越常規方法成為耐藥性研究的首選工具之一，在尋找降低細菌耐藥性的新方法和研發新藥物中發揮至關重要的作用，并更加廣泛地應用到疾病的診斷及治療中。

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s: Chen Xiang, Email: chenxiang@yzu.edu.cn; Jiao Xin-an, Email: jiao@yzu.edu.cn

Application of whole genome sequencing in bacterial antimicrobial resistance

LI Xiu, QIANG Bin, XU Zheng-zhong, MENG Chuang, CHEN Xiang, JIAO Xin-an

(JiangsuKeyLaboratoryofZoonosis/JiangsuCo-InnovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China)

Bacterial antimicrobial resistance, particularly multidrug resistance, has threaten public health and caused huge economic losses in the world.While many traditional antimicrobial resistance analysis methods are time-consuming, the whole genome sequencing, a new technology, could be a simple, rapid and efficient method applied to antimicrobial resistance analysis with great sensitivity and specificity. In addition to identifying the conventional resistant genotypes and predicting resistant phenotypes, this method may also find the potential resistance mechanisms. This article will review the research progress of whole genome sequencing application in bacterial antimicrobial resistance analysis.

antimicrobial resistance; whole genome sequence; resistance gene

陳 祥，Email：chenxiang@yzu.edu.cn；

焦新安，Email：jiao@yzu.edu.cn

揚州大學, 江蘇省人獸共患病學重點實驗室, 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，揚州 225009

Supported by the National Department Public Benefit Research Foundation (No. 201403054), the Jiangsu Innovation Program for Graduate Education (No. KYLX_1340), the Qing Lan Project and Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (No. PAPD).

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.08.003

378

A

1002-2694(2016)08-0696-04

2016-05-11；

2016-06-20

公益性行業(農業)科研專項(No.201403054)；江蘇省普通高校研究生科研創新計劃項目(No.KYLX_1340)；江蘇高校‘青藍工程’和優勢學科建設工程項目(No.PAPD)聯合資助