COL9A1基因多態性與兒童大骨節病的關聯分析

史曉薇，郭　雄

(1.西安交大醫學院第一附屬醫院兒科,陜西 西安 710061；2.西安交通大學環境與基因教育部重點實驗室與公共衛生學院地方病研究所，陜西 西安 710061)

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COL9A1基因多態性與兒童大骨節病的關聯分析

史曉薇1，郭雄2

(1.西安交大醫學院第一附屬醫院兒科,陜西 西安 710061；2.西安交通大學環境與基因教育部重點實驗室與公共衛生學院地方病研究所，陜西 西安 710061)

[摘要]目的探討COL9A1(IX型膠原α1鏈)基因多態性在兒童大骨節病(Kashin-beck disease，KBD)發病中的作用。方法2015年6至8月西安交大醫學部公共衛生學院地病所在陜西省麟游縣和永壽縣大骨節病區收集35例KBD患兒(病例組)和84例健康兒童(對照組)全血，并提取全血基因組DNA，應用Sequenom assARRAY RS1000分型技術對COL9A1上15個SNPs基因多態性位點進行基因分型，比較病例組與對照組等位基因和基因型的分布差異。結果關聯分析發現rs6910140位點突變型等位基因C的頻率在病例組為17.1%(12/70)，明顯低于對照組的38.1%(64/168)(χ2=11.5，P<0.05)；而在位點rs1135056中，突變型等位基因C的頻率在病例組為32.9%(23/70)，明顯高于對照組的17.3%(29/168)(χ2=7.03，P<0.05)。兩位點的基因型頻率分布在兩組兒童中也均存在顯著性差異(χ2值分別為12.32和10.79，均P<0.05)。結論COL9A1基因多態性與兒童KBD的易患性有關，在rs6910140基因上個體攜帶等位基因C可能與KBD易患性的降低有關，在基因rs1135056上個體攜帶等位基因C可能與KBD易患性的增加有關。

[關鍵詞]大骨節病；COL9A1基因；兒童；單核苷酸多態性

大骨節病(Kashin-Beck disease，KBD)是一種地方性、多發性、畸形性骨關節病，至今原因未明。長期以來認為該病的深層軟骨細胞壞死是由環境有害因素所致[1-2]，曾提出環境化學學說(主要有硒缺乏學說)、糧食真菌毒素學說及飲水有機物中毒學說。但環境因素不能完全解釋病區的一些流行病學現象：如即使在患病最重的家庭并非所有人均患病等。近年來對KBD的發病特點分析發現，個體的易感性可能在KBD的發病中起一定的作用[3-4]。

KBD是以關節軟骨和骺板軟骨深層軟骨細胞發生壞死繼而導致軟骨發育障礙的慢性繼發性骨關節病，是一種特殊類型的骨關節疾病，其中COL9A1基因是編碼IX型膠原的α1鏈，是透明軟骨中的主要膠原成份。研究表明IX型膠原基因突變與多種骨軟骨疾病有關[5-6]。COL9A1基因多態性與女性胯關節炎的易感性有關。另有報道表明，COL9A1基因第9外顯子的突變與先天性骨骺發育不良相關；但未見其多態性與兒童KBD易感性的報道。本研究首次通過對COL9A1基因多態性在KBD易感人群(兒童)中的關聯分析，探討COL9A1在KBD發病中的作用。

1研究對象和方法

1.1研究對象

按照我國《大骨節病診斷標準》(WS/T 207-2010)進行KBD病例的診斷和排除。2015年6至8月西安交大醫學部公共衛生學院地病所對陜西省麟游縣和永壽縣大骨節病區的119例無親緣關系(非3代以內親屬)的兒童進行研究，其中包括35例KBD兒童(病例組)和年齡、性別相匹配的84例健康兒童(對照組)。所有研究對象均進行臨床和右手正位X片檢查，均排除了其它骨關節系統疾病患者。在征得患者及家屬知情同意后抽取空腹靜脈血5mL。本研究得到了西安交通大學第一附屬醫院倫理委員會的批準。

1.2 SNPs基因分型

選擇COL9A1基因的15個SNPs位點進行研究，位點信息見表1；被選擇的SNPs位點在漢族人群中滿足r2>0.8和MAF(minor allele frequency)>0.1，全血基因組DNA提取用GoldMag純化試劑盒(陜西北美基因股份有限公司生產)，DNA濃度檢測使用Thermo Fish公司的NaNoDrop 2000c完成。多重PCR引物利用美國Sequenom公司的Assay Design 4.0進行設計，SNPs分型檢測使用美國Sequenom公司的MassArrayRS1000飛行質譜平臺，檢測數據由Sequenom公司的Typer 4.0軟件進行管理和分析。

表1COL9A1基因的研究位點信息比較結果

Table 1The loci information of the studied SNP sin COL9A1 gene

注：a指野生型等位基因/突變性等位基因。

1.3統計學方法

采用SPSS 13.0進行統計分析，SNPs的各基因型頻率在對照組中行Hardy Weinberg(HWE)檢驗[7]；采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗(超過20%格子理論頻數<5或者任何1格理論頻數<1時)比較各位點的等位基因頻率/基因型頻率在兩組中的分布；以P<0.05為有顯著性差異。

2結果

2.1被研究人群一般信息

本研究包括35例KBD兒童和84例年齡、性別匹配的健康兒童，兩組兒童性別構成(男/女：17/18與42/42；χ2=0.02，P>0.05)和平均年齡(11.30±6.79歲與11.97±7.85歲；t=0.58，P>0.05)比較均無顯著性差異。35例病例組兒童包括32例Ⅰ期和3例Ⅱ期KBD患兒。

2.2 COL9A1基因15個多態性SNPs位點與大骨節病關聯性

本次研究中15個SNPs位點在84例正常兒童的HEW檢驗結果見表1，P=0.14～0.93，均P>0.05，表明分型結果符合遺傳學定律。位點rs6910140和rs1135056等位基因(2個位點的野生型/突變型等位基因均為T/C)頻率在兩組兒童中均有顯著性差異(均P<0.05)。rs6910140位點等位基因C的頻率在病例組為17.1%(12/70)，明顯低于對照組的38.1%(64/168)，χ2=11.5，P<0.05。在位點rs1135056中，等位基因C的頻率在病例組為32.9%(23/70)，明顯高于對照組的17.3%(29/168)，χ2=7.03，P<0.05。位點rs6910140中病例組兒童TT/TC/CC基因型的頻率為62.9%(22/35)、34.3%(12/35)和2.8%(1/35)與對照組的構成比30.9%(26/84)、63.1%(53/84)和5.9%(5/84)比較有顯著性差異(χ2=12.32，P<0.05)。位點rs1135056中病例組兒童TT/TC/CC基因型的頻率為34.3%(12/35)、62.9%(22/35)和2.8%(1/35)，與對照組的構成比66.7%(56/84)、32.1%(27/84)和1.2%(1/84)比較有顯著性差異(χ2=10.79，P<0.05)。其余位點未發現有統計學差異，提示COL9A1基因多態性與兒童KBD的易患性有關，在rs6910140基因上個體攜帶等位基因C可能與KBD易患性的降低有關，在基因rs1135056上個體攜帶等位基因C可能與KBD易患性的增加有關。15個SNPs位點等位基因及基因型分布，見表2。

注：a野生型等位基因純合子/雜合子/突變型等位基因純合子。

3討論

3.1 COL9A1基因多態性與骨關節病的易感性有關

大骨節病的病因不清，遺傳因素可能與個體的易感性有關[8]。KBD和關節炎(OA)有類似的病理學特征，如軟骨細胞壞死、細胞凋亡、金屬基質蛋白退行性變化等。IX型膠原與骨關節疾病的關系已得到了專家的共識，COL9A1基因是編碼IX型膠原的α1鏈，COL9A1基因的多態性與骨關節病的易感性有關。5～13歲兒童是KBD的易患人群，本文通過關聯分析，探討COL9A1基因多態性在KBD兒童發病中的作用。

3.2 COL9A1基因中的rs6910140和rs1135056多態性與兒童大骨節病易感性有關

本文對COL9A1基因上的15個SNPs位點在KBD兒童中的研究發現，有2個SNPs位點(rs6910140和rs1135056)與兒童KBD相關聯。在rs6910140位點病例組兒童TT/TC/CC基因型的頻率為62.9%、34.3%和2.8%與對照組的構成比30.9%、63.1%和5.9%比較有顯著性差異(P<0.05)，且突變型等位基因C的頻率在病例組為17.1%，明顯低于對照組的38.1%，對照組兒童攜帶C等位基因頻率高，說明在基因rs6910140上，個體攜帶C等位基因者，其KBD的易患性降低。在位點rs1135056中病例組兒童TT/TC/CC基因型的頻率為34.3%、62.9%和2.8%與對照組的構成比66.7%、32.1%和1.2%比較有顯著性差異(P<0.05)，且突變型等位基因C的頻率在病例組為32.9%，明顯高于對照組的17.3%，病例組兒童攜帶C等位基因頻率高，說明在基因rs1135056上，個體攜帶C等位基因者，其KBD的易患性增加。本次研究結果支持COL9A1基因多態性與KBD易患性有關。目前位點rs6910140和rs1135056多態性在骨關節病中作用機制的研究報道較少，推測其與改變了a1(IX)蛋白表達的導致軟骨退行性改變與KBD的發病有關。a1(IX)在KBD患者骨關節中表達有待進一步研究。

綜上所述，COL9A1基因多態性與兒童KBD易患性有關，當然這些結論有待于今后在其它人群和較大樣本量中研究驗證。

[參考文獻]

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[2]Wang S, Duan C, Zhang F,etal.Regulatory gene networks and signaling pathways from primary osteoarthritis and Kashin-Beck disease, an endemic osteoarthritis, identified by three analysis software[J].Gene,2013,512(1):89-96.

[3]史曉薇,郭雄,張峰,等.基質金屬蛋白酶-3基因多態性與兒童大骨節病關聯分析[J].中國婦幼健康研究,2014,25(5):715-717.

[4]Shi X W, Guo X, Lv AL,etal.Heritability estimates and linkage analysis of 23 short tandem repeat loci on chromosomes 2, 11, and 12 in an endemic osteochondropathy in China[J].Scand J Rheumatol,2010,39(3):259-265.

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[專業責任編輯：潘凱麗]

Association study of polymorphism of COL9A1 gene and the risk of Kashin-Beck disease in children

SHI Xiao-wei1, GUO Xiong2

(1.Department of Pediatrics, First Affiliated Hospital of Medical Collage, Xi’an Jiaotong University, Shaanxi Xi’an 710061, China;2. Faculty of Public Health, Ministry of Education Key Laboratory of Environment and Genes Related to Disease,Xi’an Jiaotong University, Shaanxi Xi’an 710061, China)

[Key words]Kashin-Beck disease (KBD); COL9A1 gene; children; single nucleotide polymorphism

[Abstract]Objective To investigate the role of α1 of type IX collagen gene (COL9A1) in the pathologenesis and progression of Kashin-Beck disease (KBD) in children. Methods Genomic DNA of whole blood was collected from 35 KBD cases (case group) and 84 healthy children (control group) in Linyou County and Yongshou County of Shaanxi Province where faculty of public health of Xi’an Jiaotong University was from June to August in 2015. Fifteen SNPs in COL9A1 genotypes were conducted using Sequenom assARRAY RS1000. The frequencies of alleles and genotypes were compared between two groups. Results The allele frequency of mutant allele C in rs6910140 was 17.1% (12/70) in case group, which was significantly lower than 38.1% (64/168) in control group (χ2=11.5,P<0.05). But in locus rs1135056, the allele frequency of mutant allele C was 32.9% (23/70), which was higher than 17.3% (29/168) in control group (χ2=7.03,P<0.05). The frequencies of the genotype in two loci were significantly different in two groups (χ2value was 12.32 and 10.79, respectively, bothP<0.05). Conclusion Polymorphism of COL9A1 gene is associated with the liability of KBD in children. The subjects carrying allele C in rs6910140 have lower risk of KBD but those carrying allele C in rs1135056 have higher risk of KBD.

[收稿日期]2016-03-25

[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No.81273007)

[作者簡介]史曉薇(1971-)，女，副主任醫師，博士，主要從事兒童保健的研究。

[通信作者]郭雄，教授。

doi:10.3969/j.issn.1673-5293.2016.05.002

[中圖分類號]R684.1

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-5293(2016)05-0556-02