一種人工栽培霍山石斛內生真菌的分離鑒定及其組織分布

梁益敏，郁　陽，麻兵繼，王國凱，劉勁松，李守婷，王　剛

(1.安徽中醫藥大學藥學院　現代中藥安徽省重點實驗室，安徽 合肥　230012；

2.河南農業大學農學院，河南 鄭州　450002)

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一種人工栽培霍山石斛內生真菌的分離鑒定及其組織分布

梁益敏1，郁陽1，麻兵繼2，王國凱1，劉勁松1，李守婷2，王剛1

(1.安徽中醫藥大學藥學院現代中藥安徽省重點實驗室，安徽 合肥230012；

2.河南農業大學農學院，河南 鄭州450002)

[摘要]目的對霍山石斛內生真菌進行分離鑒定，為揭示霍山石斛與內生真菌的共生關系提供依據。 方法運用組織分離法對栽培霍山石斛內生真菌進行分離，采用形態學與分子生物學相結合的手段對其進行鑒定。 結果從霍山石斛中分離得到12株內生真菌，鑒定為6屬12種，分別為Fusarium guttiforme、Phyllosticta aristolochiicola、Stagonosporopsis crystalliniformis、Aspergillus tubingensis、Aspergillus flavus、Colletotrichum orchidophilum、Acrocalymma aquatica、Fusarium keratoplasticum、Fusarium bactridioides、Aspergillus ochraceus、Fusarium pseudensiforme、Colletotrichum brisbanense。結論霍山石斛中內生真菌種類豐富，且在不同組織中分布存在差異性。

[關鍵詞]霍山石斛；內生真菌；分離；鑒定

石斛藥材是蘭科(Orchidaceae)植物石斛屬(Dendrobium)多種植物新鮮或干燥莖的統稱，為我國傳統名貴中藥，在民間有“九大仙草之首”的稱譽。石斛在《神農本草經》中被列為上品，具有益胃生津、滋陰清熱、明目利嗓、鎮痛消炎等功效[1-2]。霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)又稱米斛，為石斛藥材的一種，莖直立，肉質，不分枝，具3～7節，淡黃綠色，有時帶淡紫紅色斑點，葉革質，舌狀長圓形，主產于大別山區的安徽省霍山縣[3]，為安徽道地藥材。

植物內生真菌是指其生活史中某一階段或整個階段生活在生長健康的植物組織或細胞內，并對宿主植物沒有明顯病害癥狀的一類真菌[4]。研究[5]表明，植物內生真菌與其宿主植物在長期進化過程中存在互生互惠的關系，能產生與宿主植物相同或者相似的化學成分，且不同生態環境下道地藥材和非道地藥材內生真菌的種群結構和功能具有差異性。因此，對藥用植物內生真菌的研究，可以揭示內生真菌與其植物宿主之間的共生關系，了解內生真菌對道地藥材的形成機制，有利于瀕危藥用植物資源的保護與持續利用。近年來，霍山石斛由于生長環境特殊，種子繁殖率低以及人為無限制的采挖等原因，導致自然資源嚴重匱乏，甚至瀕臨滅絕。因此，加強對霍山石斛屬藥材內生真菌的研究，探索霍山石斛藥材資源的可持續利用十分緊迫。

目前相關學者對霍山石斛藥材內生真菌報道較少，僅有王娣等[6]從中分離得到1株內生真菌，僅對宿主株高有一定的促生長作用，而對鮮重和分蘗的促進作用不明顯，筆者認為可能對其內生真菌分離株數較少，沒有相應的菌株資源而篩選不出合適的促生菌，因此，本研究分離鑒定霍山石斛的內生真菌，探索霍山石斛藥材內生真菌的多樣性，為今后系統地研究內生真菌與霍山石斛藥材品質之間的相關性提供思路。

1材料

1.1供試樣品栽培霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)健康植株于2015年6月17號采自安徽省六安市霍山縣長沖中藥材開發有限公司石斛生產基地，經安徽中醫藥大學方成武教授鑒定為蘭科石斛屬霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)。

1.2分離純化培養基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar，PDA)不含抗生素，由北京奧博星生物技術有限責任公司提供。

1.3儀器與試劑LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；JJ-CJ-2FD潔凈工作臺：吳江市凈化設備總廠；SHP-250型生化培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；DHG-9076A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；MIKRO 22R高速冷凍離心機：德國Hettick公司；T-Gradient Thermoblock PCR儀：德國Biometra公司；G-BOX凝膠成像系統Gene Snap：英國Syngene公司；DYY-8C電泳儀：北京六一儀器廠；植物/真菌基因組DNA小量提取試劑盒：上海萊楓生物科技有限公司。通用引物為內轉錄間隔區(Internal transcribed spacers, ITS)1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，均由上海生工生物工程股份有限公司定制。

2方法

2.1內生真菌的分離和純化分別取健康無病害栽培霍山石斛完整植株，用自來水沖洗干凈，去其須根和腐葉，無菌濾紙吸干表面水分，按照常規表面消毒法：依次用75%乙醇浸泡1~2 min，3%次氯酸鈉浸泡3 min，75%乙醇清洗30 s，最后用無菌水沖洗5次。用無菌濾紙吸干表面多余的水分，取最后一次無菌水200 μL涂布于PDA培養基中，平行3份，作為空白對照。倒置于恒溫培養箱中，28 ℃避光培養3~5 d，要求對照平板無菌落生成，確保表面滅菌徹底。取表面消毒后的植株，用滅菌刀片將植株的根、莖切成0.2 cm的小段；用無菌剪刀將葉剪成0.1 cm×0.1 cm的小塊，接于PDA培養基中，每個平板接3~5塊，平行3份，倒置在恒溫培養箱中，28 ℃避光培養5~15 d。每日觀察平板中內生真菌的菌落形態特征，將切口處新長出的菌絲用無菌牙簽挑取，并置于新的PDA培養基中，按上述培養條件繼續培養2~3代，確保所得菌為純菌。

參考文獻2.2內生真菌形態學鑒定方法[7]，根據所分得的真菌菌落培養特征、菌絲形態，產孢結構類型以及孢子的形態、顏色、大小進行初步鑒定分類。

2.3內生真菌分子鑒定

2.3.1內生真菌DNA提取將純化好的菌株接種于PDA平板上，28 ℃避光培養5~7 d。待平板上長滿菌絲后，用滅菌的刮刀刮取菌絲體于滅菌的研缽中。參照真菌基因組DNA小量提取試劑盒步驟進行操作得到DNA溶液，置于-20 ℃冰箱中保存、備用。

2.3.2rDNA-ITS的PCR擴增擴增真菌rDNA-ITS序列引物為：上游引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；下游引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反應體系50 μL，其中內切酶(Premix Tap)25 μL，ITS1(20 μmol/L)2 μL，ITS4(20 μmol/L)2 μL，雙蒸水19 μL，DNA模板2 μL。

PCR擴增程序：預變性95 ℃，5 min，變性95 ℃，1 min，復性49 ℃，1 mim，延伸72 ℃，2 min，30個循環，最后延伸72 ℃，10 min。擴增產物在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，1×三羥甲基氨基甲烷-乙酸(tris(hydroxymethyl)aminomethane-acetic acid, TAE)電泳緩沖液，以100 V電壓電泳約40 min，溴化乙錠(ethidium bromide, EB)染色5 min，由凝膠成像系統進行觀察，拍照。檢測后置于-20 ℃冰箱中保存、備用。

2.3.3內生真菌rDNA基因的系統發育分析將PCR擴增產物交由華大基因科技有限公司進行測序，測序結果與GenBank數據庫中的已知序列進行比對分析，采用分子進化遺傳分析軟件MEGA 5.0構建系統發育樹。其中系統進化矩陣按Kimura 2參數模型估算，采用鄰接法聚類分析構建系統發育樹，重復取樣1 000次進行自展值分析評估系統進化樹拓撲結構的穩定性，再結合序列對比，對菌株進行鑒定。

3結果

3.1內生真菌分離通過組織分離法從霍山石斛中分離得到12株，其中從根、葉中分別分離得到3株，從莖中分離得到6株。

3.2形態學鑒定分離得到的內生真菌通過菌落特征和顯微觀察，菌株HSSH01、HSSP08、HSSH09、HSSH11表面菌絲相對茂密，白色，棉絮狀，有大量分生孢子，鍥形至梭狀鐮刀形，隔膜明顯，多3個隔膜，間有4~6個隔膜，7 d之后菌絲逐漸成褐黃色，如HSSH08和HSSH11；顯微下菌絲大多粗壯，呈規則或不規則樹枝狀分布，后期菌絲顏色逐漸變深，孢子散落在菌絲中。菌株HSSH02表面分生孢子器球形，扁球形，周圍壁明顯加厚，色深，器壁較薄，多為膜質，黃褐色至深褐色，呈扇形分布，不易散落，顯微中孢子局部聚集，淺綠色，菌絲粗壯，無規則交叉分布。菌株HSSH04、HSSH05、HSSH10表面分生孢子球形、近球形、橢圓形或梨形，淡黃色或者黃色，易散落，顯微中孢子褐綠色，不規則聚集狀分布。菌株HSSH3、HSSH6、HSSH7、HSSH12因不產孢子，形態和顯微鑒定沒有意義，故只能通過分子生物學鑒定。按照魏景超[7]編著的《真菌鑒定手冊》(第一版)初步認為菌株HSSH01、HSSH08、HSSH09和HSSH11為鐮刀菌屬(Fusarium)真菌；菌株HSSH02為葉點霉屬(Phyllosticta)屬；菌株HSSH04、HSSH05、HSSH10為曲霉屬(Aspergillus)。結果見圖1。

3.3分子學鑒定

3.3.1PCR擴增產物電泳結果對分離得到的內生真菌提取DNA，得到DNA提取液，進行rDNA-ITS序列擴增，在550 bp左右處出現一條單一明亮的條帶，內生真菌DNA擴增產物電泳結果見圖2。

3.3.2rDNA-ITS序列比對以及系統發育樹的構建登陸美國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information, NCBI)網站(www.ncbi.nlm.nih.gov)，將測序結果與GenBank數據庫中已知序列進行比對分析，具體結果見表1。

表1　內生真菌分子鑒定序列比對表

對比分離得到的12株內生真菌與其同源性相似的12株已知菌種的16S DNA序列，利用MEGA 5.0和Clustal X軟件構建系統發育樹，結果見圖3。

由表1和圖3可知，霍山石斛的內生真菌分布在6個屬中，其種類資源廣泛。從霍山石斛中分離得到的內生真菌主要分布在Fusarium和Aspergillus屬中，占其總數的58.3%，為其優勢種群；另外，在霍山石斛中分離得到的Stagonosporopsis、Phyllosticta和Acrocalymma屬真菌在其他石斛屬藥材中未發現，拓展了石斛屬內生真菌的種類資源。

4討論

近年來，由于野生的霍山石斛現在已經很難再發現，且關于栽培霍山內生真菌文獻研究報道更是寥寥無幾。本實驗對所采集的栽培霍山石斛內生真菌進行分離鑒定，共分離得到12株菌種，所分離鑒定的菌株絕大多數已發現在其他石斛中[2,8-10]，如Fusarium、Aspergillus和Colletotrichum屬，這也是上述霍山石斛的優勢菌種。其他屬內生真菌如Stagonosporopsi、Phyllosticta等還沒有在相關石斛內生真菌文獻上報道過，且莖中的內生真菌的豐富度大于根和葉中，本研究結果豐富了石斛屬內生真菌的種類和資源，填補了霍山石斛內生真菌研究的空白。

內生真菌在與植物協同進化的過程中，不僅可以增強藥用植物的生物學特性，如促生長，增加抗逆性，還可以促進藥用植物的有效成分的合成和積累，陳貝貝等[11]從地黃中分離得到一株Ceratobasidium屬內生真菌，該菌能顯著促進無菌苗出根，提高盆栽苗的根冠比，顯著提高葉片中葉綠素含量，從而提高植物的光合作用能力，增強植物的生長力。馬云桐等[12]從不同產地的虎杖中分離得到164株內生真菌，盤多毛孢菌屬、芽孢菌屬真菌可促進虎杖中大黃素的合成與積累，而虎杖苷的形成與積累受擬青霉菌屬、青霉菌屬、盤多毛菌屬、地霉菌屬真菌的影響。徐文婷等[13]選用草炭土、菇渣、玉米芯等3種基質與內生真菌Chs-1-1、R2、S3制備菌劑進行鐵皮石斛田間試驗，結果表明接種處理后鐵皮石斛幼苗的存活率顯著高于對照品，最高者達95.78%，接種菌劑能有效提高幼苗的株高和根系生長，株高增幅為7.6%～59.2%，根總長增幅為19.39%～88.1%，葉綠素a、葉綠素b的含量，植株N、P、K的含量均顯著高于對照品，鎂、鐵、鋅、錳、鉻5種微量元素的含量也均高于對照品。因此，通過研究道地藥材內生真菌的種群結構，并分析其對藥材性狀，產量以及有效成分所產生的影響，有利于揭示內生真菌與道地藥材的相關性[13]。因此，本研究分離鑒定霍山石斛的內生真菌，豐富了石斛屬植物內生真菌的種類資源，為今后進一步揭示內生真菌與霍山石斛藥材之間的相關性，如促生長，增加抗逆性，有效成分的合成和積累等以及合理開發霍山石斛藥材資源提供前期研究基礎，將有利于今后實現道地霍山石斛的高效、規模化人工栽培及質量控制。

注：M.marker；1.HSSH01；2.HSSH02；3.HSSH03；4.HSSH04；5.HSSH05；6.HSSH06；7.HSSH07；8.HSSH08；9.HSSH09；10.HSSH10；11.HSSH11；12.HSSH12。

鑒于中藥石斛目前是我國珍稀瀕危的藥材品種，因此，積極研究其內生真菌的生態狀況，對揭示環境條件對藥材道地性形成的重要影響及資源的有效利用與開發，都有著重大意義。

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·方藥研究·

Isolation, Identification, and Tissue Distribution of Endophytic Fungi in CultivatedDendrobiumhuoshanense

LIANGYi-min1,YUYang1,MABing-ji2,WANGGuo-kai1,LIUJing-song1,LIShou-ting2,WANGGang1

(1.SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine&AnhuiKeyLaboratoryofModernChineseMateriaMedica,AnhuiHefei230012,China; 2.CollegeofAgronomy,HenanAgriculturalUniversity,HenanZhengzhou450002,China)

[Abstract]ObjectiveTo isolate and identify endophytic fungi from Dendrobium huoshanense, and to provide a basis for investigating the symbiotic relationship between Dendrobium huoshanense and endophytic fungi. MethodsTissue isolation was applied to isolate endophytic fungi from cultivated Dendrobium huoshanense, and morphology and molecular biology were used to identify these fungi. ResultsA total of 12 strains of endophytic fungi were isolated from Dendrobium huoshanense and identified as 12 species in 6 genera. These fungi were Fusarium guttiforme, Phyllosticta aristolochiicola, Stagonosporopsis crystalliniformis, Aspergillus tubingensis, Aspergillus flavus, Colletotrichum orchidophilum, Acrocalymma aquatica, Fusarium keratoplasticum, Fusarium bactridioides, Aspergillus ochraceus, Fusarium pseudensiforme, and Colletotrichum brisbanense. ConclusionThere are rich species of endophytic fungi in Dendrobium huoshanense, with different distributions in various tissues.

[Key words]Dendrobium huoshanense; endophytic fungi; isolation; identification

收稿日期：(2015-10-09；編輯：姚實林)

通信作者：王剛，kunhong8@163.com

作者簡介：梁益敏(1961-)，女，副教授

[中圖分類號]R931.2[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.06.024