聯合檢測糞隱血試驗與糞便DNA在大腸癌機會性篩查中的探討

鐘選芳，甘愛華，張曉慧，許岸高，肖　丹

(惠州市第一人民醫院消化內科，廣東 惠州 516001)

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聯合檢測糞隱血試驗與糞便DNA在大腸癌機會性篩查中的探討

鐘選芳，甘愛華，張曉慧，許岸高，肖丹

(惠州市第一人民醫院消化內科，廣東 惠州 516001)

[摘要]目的探討聯合檢測糞隱血試驗與糞便DNA用于大腸癌機會性篩查的應用和意義。方法入組行機會性篩查的46例大腸癌患者和30例正常者的糞便，分別應用免疫法糞便隱血試驗(IFOBT)2次，應用PCR-SSCP方法檢測糞便中APC、P53和K-ras基因突變情況。結果大腸癌組和正常組糞便IFOBT的陽性率分別為45.7%(21/46)和13.3%(4/30)，APC、P53、K-ras的突變率分別為58.7%(27/46)、65.2%(30/46)、60.9%(28/46)和3.3%(1/30)、0.0%(0/30)、0.0%(0/30)，IFOBT和糞便DNA篩查大腸癌的敏感性和特異性差異無統計學意義，兩者聯合檢測的敏感性高于任何一種單獨檢測方法。結論聯合檢測糞隱血試驗和糞便DNA可提高大腸癌篩查效率，有望成為一種有效的無創的大腸癌早期診斷和篩查方法，可用于機會性篩查。

[關鍵詞]糞隱血試驗；糞便DNA；大腸癌；機會性篩查

大腸癌是危害人類健康的常見腫瘤，其發病率居全球惡性腫瘤的第3位[1]。我國的數據顯示大腸癌發病率在近30年總體增加了36.70%，每年平均新發大腸癌病例13萬，并以年均4.20%的增幅攀升[2]。國內外研究[3]證實大腸癌的篩查能夠降低大腸癌的發病率和死亡率，但人群依從性不高，導致篩查效能不高，因此選擇何種篩查模式和方式是近年來研究的熱點。我們的研究選擇在門診就診的人群中聯合糞便隱血試驗和糞便DNA檢測，探討一種適用于大腸癌機會性篩查的方式。

1材料與方法

1.1標本來源從2011年11月至2012年8月來惠州市第一人民醫院消化門診就診的患者中，選擇符合條件進入本機會性篩查的人群中，連續性收集46例大腸癌、30例正常人糞便標本，所有標本均行免疫法糞便隱血試驗(immune fecal occult blood test,IFOBT)，并用聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP)方法檢測APC、P53、K-ras基因突變情況。所有進入本研究患者檢查及治療前均先簽署知情同意書，并獲得醫院倫理委員會批準。

1.2研究方法收集未服用瀉藥時排出的非同次糞便標本2份，量≥1 g，立即行IFOBT，剩余標本1 h內轉至-80 ℃冰箱保存用于DNA檢測；IFOBT按艾康生物技術公司的說明書操作檢測2次，結果以陽性、陰性統計，只要有1次陽性即記錄結果為陽性。糞便DNA的提取按照TIANamp Stool DNA Kit說明書操作，提取出DNA立即-20 ℃保存；根據APC、P53、K-ras的基因突變位點，使用Primer Premier 5.0 軟件設計引物(由丹麥Invitrogen公司合成)；目的DNA經PCR擴增后，用質量分數2%瓊脂糖電泳檢測目的基因條帶，PCR擴增產物進行變性、電泳、銀染，檢測基因突變的條帶，陽性標本送基因公司測序。以全結腸鏡(型號CF260，日本Olympus公司)檢查和病理組織學檢查為診斷大腸腫瘤的金標準，IFOBT、PCR-SSCP和結腸鏡檢查間均采用盲法進行。

1.3引物的序列及片段長度見表1。

1.4銀染結果判讀以某一基因單鏈條帶位置改變與正常組織相比超過3 mm以上，或出現異常條帶，則視為有突變。

1.5統計學處理采用SPSS 17.0進行統計學處理，率的比較采用χ2檢驗和Fisher確切概率法，檢驗水準取α=0.05。

2結果

2.1IFOBT、PCR-SSCP檢測結果大腸癌組和正常組IFOBT的陽性率分別為45.7%(21/46)和13.3%(4/30)。大腸癌組和正常組糞便APC、P53、K-ras的突變率分別為58.7%(27/46)、65.2%(30/46)、60.9%(28/46)和3.3%(1/30)、0.0%(0/30)、0.0%(0/30)。見表2。

2.2IFOBT、PCR-SSCP聯合檢測的價值大腸癌組糞便APC、P53、K-ras基因單獨檢測的敏感性與IFOBT比較差異均無統計學意義(P均>0.05)；APC、P53、K-ras分別聯合IFOBT檢測的敏感性均高于單獨IFOBT，差異均有統計學意義(χ2=15.525，P<0.001；χ2=22.207，P=<0.001；χ2=19.785，P<0.001)；也高于任何一項單獨基因檢測，差異均有統計學意義(χ2=7.720，P=0.005；χ2=9.202，P=0.002；χ2=9.797，P=0.002)；APC、P53、K-ras聯合IFOBT檢測大腸癌的特異性均低于單獨基因檢測，但差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表1　APC、P53、K-ras基因引物序列及PCR產物片段長度

表2　IFOBT、PCR-SSCP聯合檢測的價值

注：與IFOBT和單獨APC比較，1)P<0.05；與IFOBT和單獨P53比較，2)P<0.05；與IFOBT和單獨K-ras比較，3)P<0.05

3討論

機會性篩查是適合我國國情的篩查模式[4]，其將日常的醫療服務與目標疾病的篩查相結合，在患者就醫或體檢過程中，進行目標疾病的篩查，2011年我國將機會性篩查推薦為大腸癌的篩查模式[5]。但篩查的方法種類眾多，其中結腸鏡及病理組織學檢查是診斷腸道疾病的金標準，但結腸鏡為侵入性的有創檢查，使相當一部分的患者因害怕結腸鏡檢查過程中的疼痛、腸道準備時間長、并發癥等而拒絕篩查[6]。文獻[7]報道盡管結腸鏡有更高的準確性和治療作用，很多人還是愿意選擇無創性的篩查方法。基于糞便的篩查因無創、取材方便是近年來探討的熱點。糞便隱血試驗因操作簡便、有效、成本低廉、結果回報快速是國外指南多年來推薦的非侵入性大腸癌篩查方法，本研究中IFOBT篩查大腸癌的敏感性和特異性分別為45.7%和86.7%，與Kang等[8]的報道一致，證實了其價值。但是由于受腫瘤組織間斷性出血、早期癌可能不伴有出血、過量出血導致前帶現象等影響，IFOBT可出現許多假陰性結果，為提高敏感性，IFOBT需連續送檢多次，這又大大降低了人群參與的依從性。而且由于受上消化道出血、其他出血性腸道疾病、痔瘡出血等影響，IFOBT又可出現許多假陽性結果。

大腸癌的發生是一個多基因、多階段、多步驟的過程，涉及到原癌基因的激活和抑癌基因的失活，與大腸癌發生相關的抑癌基因主要是APC基因和P53基因，原癌基因主要是K-ras基因，其中APC和K-ras基因突變大多在大腸癌發生的早期，P53在晚期。本組糞便APC、P53、K-ras檢測大腸癌的敏感性和特異性與IFOBT相近， PCR-SSCP檢測并未顯示出優勢，考慮與大腸癌的遺傳異質性有關，目前為止還沒有發現一種在所有大腸癌組織中都異常表達的DNA分子標志物，與以往報道[9]一致，為提高大腸癌篩查的敏感性和特異性，人們對篩查方法進行了多方探討。本試驗采用PCR-SSCP檢測與大腸癌發較密切的APC、P53和K-ras基因，聯合IFOBT，探討聯合檢測在大腸癌機會性篩查中的應用價值。

Kalimutho等[10]的研究結果提示糞便DNA檢測大腸癌的敏感性和特異性分別為86%和81%。IFOBT的陽性率為51%，聯合IFOBT和糞便DNA檢測大腸癌的敏感性和特異性分別為89%和95%。意大利的研究[11]顯示聯合糞便DNA和IFOBT法可能更好地幫助明確大腸癌和評估人們患癌前和癌性病變的風險。國內伍勇等[12]檢測了68例不同大腸癌患者的糞便標本，結果顯示糞便DNA和糞隱血試驗聯合應用能將敏感性提高至94%，特異性為90%。我們的研究結果顯示IFOBT和PCR-SSCP檢測大腸癌的敏感性和特異性相近，但兩者聯合后敏感性高于任何一種單獨的無創性檢測方法，而特異性較前無明顯下降。文獻報道聯合糞便多基因檢測亦能提高敏感性，但因目前糞便DNA檢測費用仍較高，聯合多基因檢測將進一步增加篩查費用，因此我們建議在大腸癌機會性篩查中，糞便DNA和糞便隱血試驗應聯合應用，而不是相互替代，這樣既可以提高敏感性，又可以提高人群依從性，而不顯著增加篩查成本，最終提高大腸癌的篩查效能。

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Investigation of Combined Detection of Fecal Occult Blood Test and

Fecal DNA Test in the Opportunity Screening for Colorectal Cancer

Zhong Xuanfang,Gan Aihua,Zhang Xiaohui,Xu Angao,Xiao Dan

(DepartmentofGastroenterology,HuizhouFirstPeople’sHospital,Huizhou516001,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the application and significance of opportunistic screening for colorectal cancer using combined detection of fecal occult blood test and fecal DNA test.MethodsForty-six patients with colorectal cancer and 30 normal volunteers were given with opportunistic screening,and were tested using immunochemical fecal occult blood tests(IFOBT),as well as the APC,P53 and K-ras mutations in the feces were detected by using polymerase chain reaction single strand conformation polymorphism(PCR-SSCP).ResultsThe positive rate of IFOBT was 45.7%(21/46)and 13.3%(4/30)in the colorectal cancer group and the normal group,respectively.Meanwhile,the mutation rate of APC,P53,K-ras genes in the colorectal cancer group were 58.7%(27/46),65.2%(30/46)and 60.9%(28/46); and were 3.3%(1/30),0.0%(0/30)and 0.0%(0/30)in the normal group.There was no significant difference in the sensitivity and specificity between IFOBT and fecal DNA screening of colorectal cancer,and the sensitivity of joint detection was higher than any single detection method.ConclusionThe combined detection of fecal occult blood test and fecal DNA can raise the efficacy of the colorectal cancer screening,it can be used to become an effective noninvasive method of colorectal cancer in the opportunistic screening of early diagnosis and screening.

[Key words]immune fecal occult blood test; fecal DNA; colorectal cancer; opptunity screening

收稿日期：(2015-01-30)

[中圖分類號]R735.3+4；R730.1

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-5412(2015)06-0508-04

通信作者：許岸高(1962-)，男，博士，主任醫師，博士生導師，主要從事大腸癌基礎與臨床研究工作。E-mail：angao62@21cn.com

作者簡介：鐘選芳(1980-)，女，碩士，副主任醫師，主要從事消化道腫瘤基礎與臨床研究工作。E-mail：zhongxuanf@sina.com

基金項目：廣東省醫學科學技術研究基金資助項目(編號：B2011340)

DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2015.06.016