線粒體鈣單向轉運體及其蛋白相互作用的調控*

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線粒體鈣離子平衡對維持線粒體特性，介導多種細胞生理功能和病理過程具有重要的作用。雖然大家都知道線粒體鈣離子的攝取，但直到近年來才部分揭示此過程中轉運體的分子結構。本文就線粒體鈣離子單向轉運體(mitochondrial calcium unipor-ter，MCU)及其相互作用蛋白的研究進展進行綜述。

1MCU的分子結構

MCU核基因位于10號染色體，編碼的蛋白質為40 kD，此蛋白在線粒體攝取期間轉化為35 kD蛋白質的成熟形式。MCU具有2個跨膜的α-螺旋結構，這結構在不同的物種間高度保守。其N和C末端結構域跨膜進入線粒體基質中， MCU的9-aa連接器面對著兩膜間隙[1]。利用APEX檢測發現，APEX僅與MCU的N和C末端融合，使線粒體基質明顯著色，但線粒體膜間隙沒有著色[2]。研究發現，MCU低聚物可能形成一個具有功能活性的單向轉運體通道，此通道由四聚體構成，其中8個螺旋沿著假設的通道區域排列，通道的鄰近區域排列著成串的帶電氨基酸殘基，并產生負電勢，這有利于陽離子通過[3]。在線粒體DIME區域中，人類MCU的D261/E264兩個帶負電荷的氨基酸殘基發生突變，可以導致MCU失活，而使功能降低[1, 4]。

2MCU的線粒體Ca2+的單向轉運機制

線粒體快速轉運鈣離子穿過線粒體膜，并在線粒體內存有鈣離子效應器的基質中積聚[5]。驅使線粒體鈣離子吸收的動力是線粒體膜電位(Δψm)，整個線粒體內膜中均存有這膜電勢，它是由呼吸鏈復合物產生并由進入線粒體內膜的質子泵形成的一電化學勢能梯度。線粒體通過MCU進行順電化學勢能吸收Ca2+。MCU復合物的主要特性是對鈣離子具有很低的親和力，生理條件下平衡離解常數 (dissociation constant，Kd)僅為20～30 μmol/L。胞質鈣離子濃度約在5～10 μmol/L之間可以形成相當大的線粒體鈣離子內流，但在健康的活細胞中從沒有觀察到胞質具有如此的鈣離子濃度。然而有研究表明，線粒體與內質網膜在結構上臨近，在線粒體和內質網鈣離子通道間的緊密位置能形成瞬間高濃度鈣離子的微區[6-7]，確保了MCU復合物對胞質鈣離子吸收所需要的高鈣離子濃度，進而將Ca2+轉運至線粒體內，并在線粒體內迅速積聚(圖1)。

Figure 1.The structure and function of mitochondrial calcium uniporter complex.

圖1線粒體鈣單向轉運孔復合體的結構和功能

De Stefani等[4]把純化的CCDC109A/MCU重構入一個平面的脂雙層中，發現產生了Ca2+離子流，該Ca2+離子流的特性與先前Clapham等報道MCU與Ca2+離子流密切相關并促進了Ca2+攝取的結論類似。新近Chaudhuri等[8]應用線粒體膜片鉗技術證實和更新了這一觀點，他們發現通過基因敲除使人過表達MCU，則明顯改變相應的線粒體鈣離子流的變化。而MCU-S259A基因突變則損害了MCU對Ca2+的轉運，改變了釕紅的敏感性[1, 8]。這些結果表明MCU直接編碼了單向轉運體通道的亞單位，且釕紅對此轉運通道具有抑制效應。將MCU過表達，可使線粒體鈣離子攝取加倍，進而引起細胞質鈣離子濃度顯著降低[1, 4]。在MCU敲除的細胞中重新引進野生型蛋白可完全恢復了鈣離子的吸收[1]。

3MCU相互作用蛋白的調控

生理狀況下，MCU并非單獨行使功能，而是與MICU1、MICU2、MCUR1和MICUb等調節蛋白相互作用，形成大分子復合物，共同參與線粒體Ca2+的轉運，由于相互作用蛋白不同，其發揮的效應也不盡相同。

3.1MICU1的結構與調控實際上，MICU1以前稱為CBARA1和EFHA3，發現先于MCU[9]。Mootha小組正是利用MICU1作為分子探針，確定了MCU是單向轉運體的核心組成部分。在各種小鼠組織中MCU和MICU1均顯示出相同的進化模式和類似的RNA表達[10]。MICU1是一個54 kD的單跨膜蛋白，含有2個高度保守的EF臂Ca2+結合結構域。MICU1在大多數哺乳動物組織中均有表達，但在酵母中沒有發現。MICU1位于線粒體內膜(inner mitochondrial membrane，IMM)的外表面，面對膜內間隙[11]。MICU1下調可減少線粒體Ca2+含量，但并沒有明顯損害線粒體呼吸和膜電位[12]。Csordas等[11]發現MICU1在細胞內高Ca2+條件下有助于單向轉運體的激活。Foskett和Madesh等提出MICU1對MCU依賴性Ca2+積累具有重要作用。與上述結果相反，Mallilankaraman等[13]利用敲除MICU1的細胞，發現組胺誘導線粒體的Ca2+攝取不變，而且顯著增加線粒體Ca2+濃度。因此推測，在靜息或弱刺激狀態下，當細胞內Ca2+濃度較低時，MICU1可能限制MCU對Ca2+的轉運。當MICU1缺失，線粒體Ca2+處于超載狀態。Csordas等[11]認為MICU1在MCU介導的Ca2+攝取中起到一個Ca2+高親和閘門作用，而這種作用與所謂的Ca2+攝取快速模式(RAM)相關聯。在這種模式下，加入Ca2+時，MCU最初非常迅速吸收Ca2+，當線粒體基質內Ca2+增加時，MICU1通過EF臂區域結Ca2+，對MCU依賴性Ca2+內流起到了抑制作用[12]。總之，一方面MICU1穩定了MCU復合物，限制了靜息條件下線粒體鈣離子的攝取，或者通過MICU1與Ca2+結合，限制了線粒體鈣離子的進入。另一方面，MICU1也可能與MCU協同使Ca2+進入線粒體內，確切轉運及其機制還有待進一步研究證明之。

3.2MICU2的結構與調控MICU1有2個同源體，即人基因EFHA1和EFHA2的蛋白產物，此類蛋白與MICU1的序列有25%同源性。這2種蛋白質都具有N末端線粒體的靶向定位序列，并在多個小鼠組織中都能檢測到。它們分別被命名為MICU 2和MICU3[14]。由于MICU 3在線粒體中沒有明顯的特定定位，所以目前被排除在列表之外[15]。MICU2在線粒體中則有明確定位，與MICU1類似，具有高度保守的EF臂結構域。MICU2與MICU1和MCU相互作用[14]，與MICU1類似，MICU2應該位于線粒體膜間隙(intermembrane space，IMS)，在線粒體基質蛋白中沒有發現[16]。體內沉默MICU2不影響ΔΨm或線粒體呼吸鏈，但可增加線粒體Ca2+的難度[14]。MICU2沉默可以發現線粒體Ca2+降低，且在MICU1沉默的HeLa細胞中，若使MICU2過表達，則可恢復線粒體的Ca2+攝取，其表型更接近于野生型。研究表明MICU1、MICU2和MCU均位于同一復合物中[14]。它們之間相互協同，如在小鼠肝臟細胞中，用siRNAs沉默MICU1和MICU2可導致MCU蛋白表達降低，并且MCU復合物的大小發生轉變；在HEK293細胞中，MICU1敲除可導致MICU2水平的降低。此外，MCU的過表達可增加MICU1和MICU2表達；在HeLa細胞中，MICU1下調導致MICU2蛋白水平降低，反之亦然。

3.3MCUb的結構與調控MCUb(以前為CCDC109B)是MCU的同源體，為一個33 kD的蛋白，與MCU具有50%的相似性。它的蛋白質拓撲結構與MCU非常相似，同樣有2個面對著IMS的 N和C末端的跨膜結構域，但MCUb 表達水平較低，表達譜也有所不同，與MCU相比較， MCUb的mRNA水平是很低的。MCUb mRNA在心臟和肺組織中有很高的表達，但在骨骼肌組織中表達少。MCU與MCUb相互作用，在完整細胞中，MCUb的過表達可減少線粒體Ca2+攝取。MCUb表現為一種內源性負性顯性特征。在復合物中，插入一個或多個MCUb亞基，將延緩線粒體對Ca2+的攝取[3]。

3.4MCUR1的結構與調控研究表明線粒體Ca2+單向轉運體調節子1在45類線粒體蛋白中進行siRNA掃描，發現它是控制Ca2+吸收的必需調節子，主要存在于IMM上，包含2個跨膜區域和1個螺旋線圈區域。通過使用蛋白酶K生化法確定了MCUR1的拓撲結構，它的N和C末端殘基的突出進入IMS中，提示MCUR1可能為線粒體基質蛋白中重要組成，對線粒體Ca2+攝取和基質內Ca2+穩態中起著重要作用。MCUR1沉默導致線粒體內Ca2+濃度減少。有實驗研究表明，MCUR1與MCU相互作用，但不與MICU1相互作用[17]。在HeLa細胞中過表達MCUR1可增加線粒體內Ca2+濃度。同樣，在MCUR1沉默的細胞中，MCU的過表達未能恢復Ca2+的含量，表明這MCU和MCUR1對于Ca2+轉運存在關聯性。值得注意的是，在MCUR1耗竭的細胞中，MCU的mRNA和蛋白表達是上調的，提示2種蛋白間可能存在某種依存關系。

3.5EMRE的結構與調控EMRE(以前稱為C22ORF32)，是單向轉運體復合物的一個組成部分[18]，為10 kD的單跨膜蛋白，位于IMM上，具有高度保守的富含有天冬氨酸C末端區域[19]。值得注意的是，在任何植物、原生動物和真菌中均未發現其同源物，表明EMRE是一個后生多細胞動物的進化產物。EMRE與IMS中的MICU1和內膜上的MCU低聚物相互作用，可能在MICU1/MICU2和MCU之間起到橋梁作用。EMRE下調可使線粒體內Ca2+顯著降低，提示線粒體Ca2+攝取需要EMRE的參與[19]。在EMRE沉默的細胞中，過表達MCU并不能恢復線粒體Ca2+吸收，也提示二者存在相互作用。EMRE蛋白的表達是嚴格依賴于MCU的多少，作為一個分子伴侶，可能類似于MICU1/MICU2。在MCU耗竭的細胞中，盡管mRNA水平沒有改變，但EMRE蛋白含量急劇下降。

4MCU復合物的病理生理學意義

現在認為線粒體內游離Ca2+濃度發揮著重要的生理病理作用，如細胞內的能量調節、細胞內Ca2+信號調控及缺血再灌注損傷等，特別對Ca2+平衡的調節，起著核心作用。線粒體Ca2+攝取在有氧代謝[20]和細胞存活[21]的調控過程中起著關鍵的作用。幾種癌基因和腫瘤抑制因子調控著Ca2+發揮其抗/促凋亡的活性，并且線粒體Ca2+超載在許多病理狀態中與細胞凋亡或壞死相關聯[21]。在促凋亡刺激的條件下，過表達MCU的細胞表現出增強了細胞凋亡的效應，說明增加MCU與細胞死亡的易感性具有相關性[3]，而Marchi等[22]研究顯示，在MCU的表達和細胞凋亡的過程中有miRNA調控的參與。下調MCU后，線粒體Ca2+攝取，這使線粒體Ca2+含量降低，Ca2+依賴的細胞凋亡減弱[22]。 除了癌癥，在心肌細胞中，沉默MCU基因，胞內Ca2+濃度顯著增加，并與增加收縮反應有相關性[23]。在缺血再灌注損傷和心肌梗死時，CaMKII通過增加MCU復合體的活性，促進心肌細胞凋亡，降低心肌功能[24]。其可能的機制是，CaMKII在基質中與MCU相互作用，促進MCU絲氨酸57和92磷酸化，增加MCU的功能所致[24]。在胰腺β細胞中，MCU和MICU1依賴的Ca2+積聚將調節ATP水平、葡萄糖代謝和胰島素分泌[25-26]。有報道MCU沉默將損害葡萄糖誘導的Ca2+依賴性ATP增加，加速2型糖尿病的病理過程[26]。

5結束語

自一百多年以前描述線粒體作為生物細胞的多功能的基本細胞器以來，已知線粒體在能量代謝、信號轉導、離子運輸，以及維持細胞內環境平衡起到了不可替代的作用。現由于MICU1、MICU2、 MCUR1和EMRE等MCU復合體調控蛋白分子的發現，為進一步研究線粒體的結構和功能特性鋪平了道路。我們都知道，線粒體Ca2+信號的分子研究才剛剛開始，我們在研究Ca2+單向轉運體的同時考慮到其與其它作用因子之間的關系是很重要的，這些因子包括MICU1、MICU2、 MCUR1和EMRE，還有本文沒有討論到的Letm1[27]、UCPs[28]、TRPC3[29]和NCLX[ 30 ]等因子，對這些因子的研究為我們研究線粒體Ca2+攝取提供了新的認識，更重要的是為研究線粒體鈣離子平衡對維持多種細胞的生理功能和誘導致病的病理機制提供了更高的平臺。

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)

線粒體鈣單向轉運體及其蛋白相互作用的調控*

徐斌，李泱△

(解放軍總醫院心血管內科，北京 100853)

Mitochondrial calcium uniporter complex and regulation of their protein interactionXU Bin, LI Yang

(DepartmentofCardiology,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,China.E-mail:liyangbsh@163.com)

[ABSTRACT]Mitochondrial calcium homeostasis plays a key role in maintaining various cellular characteristics and mediating cellular physiological function and pathological processes. Although it has long been known that mitochondria takes up Ca2+, the molecular identities of the channels and transporters involved in this process are revealed only recently. Here, we review the structure and function of the channel-forming subunit, mitochondrial calcium uniporter (MCU) and its regulators, which include MICU1, MICU2, and MCUR1.

[關鍵詞]線粒體； 鈣單向轉運體； 鈣平衡

[KEY WORDS]Mitochondria; Calcium uniporter; Calcium balance

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.031

[中圖分類號]R363

[文獻標志碼]A