趨化素通過上調磷酸化JNK促進小鼠血管平滑肌細胞的增殖*

熊　瑋，　董少紅△，　張　鍵，　李江華，　廖碧紅，　龐新利，　羅林杰

(1暨南大學第二臨床醫學院/深圳市人民醫院心內科，廣東 深圳 518020；2中國科學院深圳先進技術研究院，廣東 深圳 518055)

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趨化素通過上調磷酸化JNK促進小鼠血管平滑肌細胞的增殖*

熊瑋1，董少紅1△，張鍵2，李江華1，廖碧紅1，龐新利1，羅林杰1

(1暨南大學第二臨床醫學院/深圳市人民醫院心內科，廣東 深圳 518020；2中國科學院深圳先進技術研究院，廣東 深圳 518055)

[摘要]目的： 利用慢病毒構建趨化素基因缺陷性小鼠血管平滑肌細胞株，觀察沉默趨化素基因后血管平滑肌細胞的增殖情況并探討其機制。方法: 將正常血管平滑肌細胞、趨化素基因干擾對照血管平滑肌細胞株和趨化素基因缺陷性血管平滑肌細胞株分成正常組、增殖組、對照組和沉默組，增殖組加入血小板源性生長因子BB促進增殖，采用細胞計數和BrdU法檢測血管平滑肌細胞增殖，采用Western blot檢測絲裂原激活蛋白激酶( MAPK)信號通路的蛋白水平。結果: 增殖組血管平滑肌細胞的細胞數目和BrdU的A值顯著高于正常組(P<0.05)；與正常組相比，沉默組的血管平滑肌細胞數目和BrdU的A值顯著降低(P<0.05)；與此同時，對照組與正常組之間的血管平滑肌細胞增殖情況無明顯差異。各組血管平滑肌細胞之間的p-ERK1/2、ERK1/2、p-p38 MAPK和p38 MAPK水平無明顯變化，增殖組血管平滑肌細胞的p-JNK蛋白表達增加，而沉默組血管平滑肌細胞的p-JNK水平下降。結論: 趨化素具有促進小鼠血管平滑肌細胞增殖的作用，該作用可能與p-JNK表達上調相關。

[關鍵詞]血管平滑肌細胞； 趨化素； 細胞增殖； c-Jun氨基末端激酶

再狹窄是冠狀動脈介入治療之后的主要并發癥，其發生是由于介入損傷和血管局部炎癥反應導致血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖和遷移到內膜下、分泌細胞外基質的結果[1]。趨化素(chemerin)是一種新發現的脂肪因子，是孤獨G蛋白偶聯受體CMKLR1的內源性配體[2]。研究發現，人冠狀動脈周圍的脂肪組織及冠狀動脈病變部位的VSMCs和泡沫細胞均可高表達趨化素，冠心病患者血漿中的趨化素水平亦明顯升高，表明趨化素可能與冠狀動脈粥樣硬化的發生相關[3- 4]。我們在前期實驗中利用慢病毒構建了趨化素基因缺陷性VSMC株，在本研究中我們檢測沉默趨化素基因后VSMCs的增殖情況并探討其機制。

材料和方法

1試劑和耗材

SPF級NIH小鼠購自廣東省實驗動物中心；DMEM培養基、0.25%胰酶和FBS購自Gibco；小鼠α-SMA抗體購自博士德公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen；BamHⅠ和EcoRⅠ限制性內切酶購自Thermo；T4DNA ligase購自NEB；MinElute Reaction Cleanup Kit、Endo-free Plasmid Max Kit購自Omega；PrimeScript RT reBamHnt Kit和Lenti-X Lentiviral Expression Systems購自TaKaRa；趨化素抗體、p-ERK1/2抗體、磷酸化p38絲裂原激活的蛋白激酶(phosphorylation p38 mitogen- activated protein kinase，p-p38 MAPK)抗體和p-JNK抗體購自Abcam；ERK1/2抗體和p38 MAPK抗體購自Santa Cruz； BrdU抗體購自Biovision。引物由生工公司合成。

2趨化素基因缺陷性VSMC株構建和鑒定

按照我們之前建立的方法[5]培養小鼠VSMCs，培養成功后分別將攜帶趨化素shRNA和趨化素shRNAc對照基因的慢病毒感染VSMCs，用嘌呤霉素對細胞進行篩選，篩選完成后提取細胞中RNA和蛋白，分別用real-time PCR和Western blot檢測VSMCs中趨化素的mRNA和蛋白。

實驗分成正常(normal)組、增殖(PDGF)組、對照(control)組和沉默(knockdown)組，normal和PDGF為正常VSMCs，control為趨化素shRNAc對照慢病毒VSMC株，knockdown為趨化素基因缺陷性VSMC株。PDGF組細胞在傳代后加入終濃度為20 μg/L的血小板源性生長因子BB(platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB)刺激VSMCs增殖；normal組、control組和knockdown組VSMCs加入同等體積的PBS。

3實驗方法

3.1VSMCs增殖實驗細胞消化離心后以每孔1×104個細胞接種到96孔板，每組設6個復孔，24 h后進行轉染，4～6 h后換成100 μL完全培養基。在加入PDGF-BB后48 h時吸盡培養板中的培養基，用0.25%含EDTA的胰酶30 μL充分消化，加入70 μL培養基，充分吹打以使消化下來的細胞完全混勻，吸取10 μL細胞懸液，用計數板在顯微鏡下計算各組VSMCs數目的變化。

另行BrdU ELISA實驗。在加入PDGF-BB后48 h時分別在每孔加入BrdU標記溶液10 μL，輕柔混合均勻，在37 ℃、5%CO2培養箱中繼續培養10 h，加入FixDenant溶液200 μL，室溫孵育30 min后，1 500 r/min離心5 min，移除上清液，之后加入anti-BrdU-POD 工作液100 μL，室溫孵育90 min，1 500 r/min離心5 min，移除上清液，用沖洗緩沖液 250 μL反復沖洗3遍后，移除上清液；加入底物溶液100 μL，室溫孵育20 min；加入1 mol/L H2SO4溶液25 μL，300 r/min離心1 min，在15 min內用酶聯免疫檢測儀測定450 nm波長(參考波長690 nm)的吸光度(A)值。

3.2Western blot實驗細胞傳代生長48 h后常規提取總蛋白，每孔加入20 μL蛋白溶液，在10%的SDS-PAGE中80V、30 min及120V、1 h進行電泳分離，半干轉液38 mA、90 min轉入PVDF膜，5%牛奶封閉2 h，加入兔抗小鼠的I 抗(p-ERK1/2稀釋比例為1∶200，ERK1/2為1∶100，p-p38 MAPK為1∶200,p38 MAPK為1∶100,p-JNK為1∶200,GAPDH為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，1‰ TBST洗10 min 3次，加入羊抗兔 II 抗(1∶6 000)孵育1 h，1‰ TBST洗10 min 3次，加入ECL發光液100 μL在ImageQuant RT ECL冷CCD成像系統進行顯影，用ImageQuant TL軟件進行半定量分析。

4統計學處理

所有數據以均數±標準差(mean±SD)表示，使用SPSS 12.0統計學軟件分析，各組間比較采用單因素方差分析，各組均數間的兩兩比較用SNK-q檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

結果

1VMSCs培養及鑒定

用免疫熒光鑒定小鼠血管平滑肌細胞中α-SMA表達，在胞漿見到大量陽性熒光顆粒，與細胞核融合，表明血管平滑肌細胞培養成功,見圖1。

Figure 1.The immunofluorescence staining of mouse VSMCs (×100).

圖1小鼠血管平滑肌細胞免疫熒光染色

2趨化素基因缺陷性VMSC株構建和鑒定

采用real-time PCR檢測3種細胞株中趨化素的mRNA，Western bolt檢測趨化素蛋白，結果顯示，空白對照組的VSMCs (normal)和轉染shRNAc的VSMCs (control)之間趨化素mRNA和蛋白無明顯差異，而轉染pLVX- Chn1 shRNA的基因缺陷性VMSCs(knockdown)的趨化素mRNA和蛋白水平明顯下降(P<0.01),見圖2，表明趨化素基因缺陷性VSMC株構建成功。

Figure 2.The mRNA and protein levels of chemerin in the VSMCs with different treatments were measured by real-time PCR and Western blot. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsnormal.

圖2Real-time PCR和Western blot檢測VSMC株的趨化素mRNA和蛋白水平

3趨化素對血管平滑肌細胞增殖的影響

分別采用BrdU和細胞計數2種方法檢測沉默趨化素基因后VSMCs的增殖情況。結果顯示PDGF組的VSMCs數目和BrdU的A值顯著高于正常VSMCs(P<0.05)，表明PDGF-BB促進了VSMCs的增殖；與normal組相比，趨化素基因缺陷性VSMC株的細胞數目和BrdU的A值顯著降低(P<0.05)；與此同時，作為對照的趨化素shRNAc慢病毒VSMC株與normal組之間的VSMCs增殖情況無明顯差異,見圖3、4。以上結果表明趨化素具有促進VSMCs增殖的作用。

Figure 3.The number of VSMCs was measured by cell counting. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnormal.

圖3細胞計數法檢測VSMCs增殖

4Western blot實驗結果

細胞生長48 h后測定各組VSMCs的蛋白，各組細胞p-ERK1/2、ERK1/2、p-p38 MAPK和p38 MAPK的蛋白水平無明顯差異；與normal組VSMCs相比，PDGF組VSMCs的p-JNK水平增加，而knockdown組VSMCs的p-JNK蛋白水平下降(P<0.05),見圖5。

Figure 4.The BrdU absorbance of the VSMCs with different treatments. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnormal.

圖4BrdU法檢測VSMCs的增殖

Figure 5.The proteins levels of MAPK pathway-related molecules were measured by Western blot.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal.

圖5Western blot檢測MAPK通路相關蛋白的水平

討論

研究表明，趨化素具有調節脂肪細胞分化、促進脂質代謝、調節炎癥和免疫反應等生物學效應，被認為是代謝綜合征的標志物。在2型糖尿病患者中發現其血清趨化素水平明顯升高，在進行減肥手術后趨化素水平明顯下降[6]。關于趨化素的研究主要集中在代謝綜合征和2型糖尿病。最近，Spiroglou等[3]研究發現，人冠狀動脈周圍的脂肪組織及冠狀動脈病變部位的VSMCs和泡沫細胞均可高表達趨化素，且冠狀動脈粥樣硬化病變的嚴重程度與趨化素的水平呈正相關；在猝死患者的尸體解剖中也發現，冠狀動脈不穩定斑塊中的泡沫細胞和內皮細胞均存在趨化素高表達。Kaur等[7]發現人血管內皮細胞存在趨化素受體CMKLR1，TNF-α、IL-1β、IL- 6等促炎癥因子可使其表達上調；趨化素與CMKLR1受體結合后可通過活化p42/44 MEK信號通路，誘導血管內皮細胞增殖和新生血管形成。Yoo等[8]檢測了58例肥胖患者的血清趨化素，發現趨化素與踝肱指數、體重指數、胰島素抵抗、低密度脂蛋白、甘油三酯、超敏C反應蛋白等呈正相關，與頸動脈內膜厚度不相關，認為循環趨化素水平升高是動脈粥樣硬化的獨立危險因素。研究[4]還發現，冠心病患者血漿趨化素顯著升高，與冠狀動脈病變支數、心率、血壓、白細胞數量、中性粒細胞比例、纖維蛋白原、空腹血糖和肌酐水平等密切相關。最近，Watts等[9]發現趨化素在血管周圍的脂肪組織中高表達，而CMKLR1則在血管中膜及內膜均有表達，用CMKLR1受體的激動劑chemerin-9可以呈濃度依賴地促進胸主動脈收縮，相反CMKLR1受體的拮抗劑CCX832可以抑制去甲腎上腺素和前列腺素 F2α誘導的胸主動脈收縮。以上研究均表明趨化素可能與動脈粥樣硬化的發生和進展相關，但目前對于趨化素在動脈粥樣硬化中的作用存在爭議，如Lehrke等[10]認為血清趨化素水平雖與血糖、血脂水平呈正相關，但不能預測冠脈病變的發生。

MAPK是將信號從細胞表面轉導至細胞內的重要傳遞者，在細胞增殖、遷移、凋亡、機體生長發育以及免疫應答等多種細胞生物過程中發揮著重要作用[11]。在自發性高血壓大鼠中，MAPK的活化可促進VSMCs的增殖[12]，氧化性低密度脂蛋白促進VSMCs分泌趨化因子也與MAPK活化有關[13]，而且阻斷MAPK信號通路可以抑制動脈損傷后的內膜增生和血管平滑肌細胞增殖[14]。在本研究中，我們采用RNA干擾的方法，利用慢病毒載體構建了趨化素基因缺陷性血管平滑肌細胞系，用real-time PCR檢測細胞系中趨化素的mRNA水平，與正常組和對照組VSMCs相比，該細胞系的趨化素mRNA水平顯著降低，表明趨化素基因缺陷性VSMC系構建成功；采用細胞計數和BrdU法檢測血管平滑肌細胞增殖，與正常VSMCs相比，趨化素基因缺陷性VSMCs系的細胞數目和BrdU的A值均明顯下降，表明趨化素具有促進VSMCs增殖的作用。對MAPK信號通路的關鍵分子檢測發現，各組VSMCs的p-ERK1/2、ERK1/2、p-p38 MAPK和p38 MAPK水平無明顯變化，增殖組血管平滑肌細胞的p-JNK蛋白表達增加，而沉默組血管平滑肌細胞的p-JNK水平下降。

綜上所述，我們首次發現趨化素具有促進血管平滑肌細胞增殖的作用，該作用可能與磷酸化JNK被活化相關。

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(責任編輯： 盧萍， 羅森)

*[基金項目]衛生部公益性行業科研專項(No. 200802173)

Chemerin promotes proliferation of mouse vascular smooth muscle cells by up-regulating p-JNKXIONG Wei1, DONG Shao-hong1, ZHANG Jian2, LI Jiang-hua1, LIAO Bi-hong1, PANG Xin-li1, LUO Lin-jie1

(1DepartmentofCardiology,SecondClinicalMedicalCollegeofJinanUniversity,ShenzhenPeople’sHospital,Shenzhen518020,China;2ShenzhenInstitutesofAdvancedTechnology,ChineseAcademyofSciences,Shenzhen518055,China.E-mail:dsh266@medmail.com.cn)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the proliferation property of stable chemerin gene knockdown vascular smooth muscle cells (VSMCs) and to explore its mechanism. METHODS: The normal VSMCs, chemerin gene interfering control VSMCs and stable chemerin gene knockdown VSMCs were divided into normal group, PDGF group, control group and knockdown group. The VSMCs in PDGF group were given platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB) to initiate proli-feration. The cell counting and BrdU assay were employed to investigate the proliferation property of VSMCs. The mitogen-activated protein kinase (MAPK) signal pathway was determined by Western blot. RESULTS: The cell number and BrdU A value in PDGF-BB-treated VSMCs significantly increased as compared with the normal VSMCs(P<0.05).Compared with the normal VSMCs, the chemerin knockdown VSMCs showed obviously decreased cell number and BrdU A value (P<0.05).Simultaneously, no significant difference in the proliferation of VSMCs between the normal VSMCs and the control VSMCs was observed. No significant difference of the protein levels of p-ERK1/2, ERK1/2, p-p38 MAPK and p38 MAPK among 4 kinds of VSMCs was found. The protein level of p-JNK in PDGF-BB-treated VSMCs was up-regulated, while it was down-regulated in chemerin knockdown VSMCs compared with the normal VSMCs. CONCLUSION: Chemerin promotes the proliferation of mouse vascular smooth muscle cells by up-regulating p-JNK production.

[KEY WORDS]Vascular smooth muscle cells; Chemerin; Cell proliferation; c-Jun N-terminal kinase

通訊作者△Tel: 0851-28609838； E-mail： zyyutian@126.com

[收稿日期]2015- 07- 01[修回日期] 2015- 09- 25

[文章編號]1000- 4718(2015)12- 2287- 05

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.029

[中圖分類號]R363

[文獻標志碼]A