白藜蘆醇對血管緊張素Ⅱ誘導的平滑肌細胞

李自立+章若涵

[摘要]目的 探討白藜蘆醇對血管緊張素Ⅱ誘導的平滑肌細胞增殖的抑制作用。方法 體外培養大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞（VSMCs），將細胞分為血管緊張素組、白藜蘆醇梯度組、聯合組及對照組，檢測評價白藜蘆醇和血管緊張素對VSMCs增殖能力的影響，各組均反應0、6、12、24 h，根據細胞計數來評價VSMCs的增殖情況，采用MTT比色法檢驗VSMCs活力，對結果進行對比分析。結果 從各組的細胞計數結果來看，總體結果為血管緊張素組>聯合組>白藜蘆醇梯度組>對照組，其中血管緊張素組VSMCs的細胞計數結果顯著高于對照組，培養24 h時，白藜蘆醇梯度組中30 μmol/L濃度下細胞計數最低（P<0.05），而聯合組中30、100 μmol/L濃度下細胞計數均顯著低于10 μmol/L（P<0.05）；從各組細胞活力情況來看，總體結果為血管緊張素組>聯合組>白藜蘆醇梯度組>對照組，培養24 h時，同樣白藜蘆醇梯度組中30 μmol/L濃度下細胞計數最高（P<0.05），而聯合組中30、100 μmol/L濃度下細胞計數均顯著低于10 μmol/L（P<0.05）。結論 白藜蘆醇對于血管平滑肌細胞增殖有著一定的作用，且對于血管緊張素Ⅱ所誘導的增殖有著較強的抑制效果，不同濃度下作用效果有所差異。

[關鍵詞]平滑肌細胞；白藜蘆醇；血管緊張素Ⅱ；細胞增殖

[中圖分類號] R965 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）01（b）-0010-03

動脈粥樣硬化癥是多種心腦血管疾病的基礎，相關研究顯示，炎癥因子刺激下主動脈血管平滑肌細胞（VSMCs）增生是導致動脈粥樣硬化發生發展的一個重要因素[1-2]。近年來紅酒中的提取物白藜蘆醇在心血管疾病防治中的作用逐漸被重視，有學者研究顯示白藜蘆醇能夠有效抑制冠心病模型大鼠動脈粥樣硬化的程度[3]。血管緊張素Ⅱ是一種生物活性肽，具有較強的收縮血管、刺激心肌肥大的作用，同時也能夠促進VSMCs的增殖，血管緊張素Ⅱ誘導下的VSMCs增殖是導致動脈粥樣硬化發生的重要病理基礎[4]。本文就白藜蘆醇對血管緊張素Ⅱ誘導的平滑肌細胞增殖的抑制作用進行了研究分析，現報道如下。

1材料與方法

1.1材料與試劑

清潔劑SD大鼠4～5只，均由南華大學實驗動物學部動物實驗中心提供；白藜蘆醇、血管緊張素Ⅱ均由美國Sigma公司提供，細胞計數試劑盒及MTT試劑盒由北京利維寧生物科技有限公司提供。

1.2原代細胞培養及鑒定

采用組織貼塊法培養大鼠胸主動脈VSMCs，在顯微鏡下觀察細胞的生長情況，采用免疫熒光法進行細胞鑒定，以出現顆粒狀綠色沉淀為陽性反應。

1.3試驗方法

選擇3～5代VSMCs進行試驗，制備細胞懸濁液，控制密度為5.0×107/L，接種在培養板上待用，在37℃環境下采用10%胎牛血清進行預培養24 h后分組，分為血管緊張素組（加入1 μmol/L的血管緊張素Ⅱ進行處理）、白藜蘆醇梯度組（加入10、30、100 μmol/L白藜蘆醇進行處理）、聯合組（加入1 μmol/L的血管緊張素Ⅱ+10、30、100 μmol/L白藜蘆醇進行處理）及對照組（不做特殊處理），分別于反應0、6、12、24 h時進行檢測。VSMCs在培養完成后加DMEM培養液同步化24 h，根據實驗分組給予不同的處理措施，并采用含有10%胎牛血清的培養液繼續培養，分別在對應時間進行細胞計數統計，重復試驗3次，每次3個復孔。細胞活力檢測采用MTT法，按照每孔1×103個細胞接種在96孔板上，采用培養液培養24 h并同步化，根據實驗分組不同給予不同的處理措施，之后在不同時間點采用MTT法檢驗細胞活力，490 nm波長下測量A值，重復3次，每次6復孔。

1.4統計學方法

采用SPSS 20.0軟件包對數據進行處理，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，組間對比采用單因素方差分析，兩兩對比采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1白藜蘆醇對VSMCs細胞計數的影響

從各組的細胞計數結果來看，總體結果為血管緊張素組>聯合組>白藜蘆醇梯度組>對照組，其中血管緊張素組VSMCs的細胞計數結果顯著高于對照組；培養24 h 時，白藜蘆醇梯度組中30 μmol/L濃度下細胞計數最低（P<0.05）；聯合組中30 、100 μmol/L濃度下細胞計數均顯著低于10 μmol/L（P<0.05）（表1）。

2.2白藜蘆醇對VSMCs細胞活力的影響

從各組細胞活力情況來看，總體結果為血管緊張素組>聯合組>白藜蘆醇梯度組>對照組，其中血管緊張素組VSMCs的細胞計數結果顯著高于對照組；培養24 h時，同樣白藜蘆醇梯度組中30 μmol/L濃度下細胞計數最高（P<0.05）；聯合組中30、100 μmol/L濃度下細胞計數均顯著低于10 μmol/L（P<0.05）（表2）。

3討論

動脈粥樣硬化是由于動脈壁內膜的一系列細胞改變的最終結果，同時也是引發多種心腦血管疾病的重要病理基礎，近年來的發生率逐漸上升，嚴重危害患者健康[5-6]。有流行病學調查顯示，長期適量飲用葡萄酒的人群心血管疾病的發生率和死亡率均相對低于其他人群[7]，這一調查表明葡萄酒中的某些成分可能能夠抑制動脈粥樣硬化病變的發生發展。進一步的研究顯示，葡萄酒中含量較高的白藜蘆醇具有多種藥理學作用，包括抗炎、抗血小板、保護心血管等[8-10]，可能是抑制動脈粥樣硬化的重要原因。

主動脈VSMCs的增殖是冠狀動脈硬化的基礎，同時也是誘發高血壓、冠心病及介入術后再狹窄等疾病的主要原因[11-13]。血管緊張素Ⅱ是一種重要的血管活性物質，能夠特異性地誘導VSMCs的增殖。近年來的研究顯示，抑制血管緊張素Ⅱ導致的VSMCs增殖可有效防止心血管疾病的進一步發展[14]。目前白藜蘆醇用于動脈粥樣硬化的防治作用已有報道，但關于白藜蘆醇對血管緊張素Ⅱ誘導下的VSMCs增殖作用國內報道尚少。白藜蘆醇的心血管保護作用機制涉及抑制血小板聚集和組織因子的表達、促進血管舒張、抑制脂質過氧化、抑制血管平滑肌細胞增殖等。在關于白藜蘆醇與PI3K-Akt信號通路相關性的一項研究中顯示，白藜蘆醇預處理后，心肌組織中Bcl-2蛋白表達上調，Bax蛋白表達下調，Bax/Bcl-2下調，心肌細胞凋亡的數量顯著下降[15]。同時應用白藜蘆醇和渥曼青霉素時，白藜蘆醇的上述作用顯著減弱，這一結果提示白藜蘆醇減少心肌細胞凋亡的機制可能是通過上調Bcl-2蛋白的表達，下調Bax/Bcl-2來實現的，且有PI3K-Akt信號通路的參與。此外，NO還可以通過影響缺血再灌注過程中的炎癥反應過程，減少心肌細胞壞死和凋亡，而白藜蘆醇能夠提高心肌組織中的NO含量及活性。本次研究中通過體外實驗來評估白藜蘆醇對VSMCs的抑制作用，并評價了其對血管緊張素Ⅱ誘導下的VSMCs增殖的抑制效果。從研究數據來看，血管緊張素組的VSMCs細胞計數及細胞活力均隨著培養時間的延長而逐漸上升，說明血管緊張素可顯著地增加VSMCs細胞的增殖能力。從白藜蘆醇的抑制作用來看，10 μmol/L濃度下的白藜蘆醇并不能有效抑制VSMCs的增殖，而30、100 μmol/L濃度下VSMCs細胞計數及細胞活力均得到有效抑制，說明白藜蘆醇具有濃度依賴性的特點。從血管緊張素Ⅱ誘導下的VSMCs增殖抑制情況來看，基本與常規抑制結果相近，同樣在30、100 μmol/L濃度下能夠有效控制VSMCs的增殖。說明白藜蘆醇可有效抑制血管緊張素Ⅱ誘導下的VSMCs增殖，分析原因可能與白藜蘆醇的抗氧化作用有關。但由于研究時間等因素所限，本次研究中未能闡明其作用機制，尚需進一步深入研究證實。

綜上所述，白藜蘆醇對于血管平滑肌細胞增殖有著一定的作用，且對于血管緊張素Ⅱ所誘導的增殖有著較強的抑制效果，不同濃度下作用效果有所差異。

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（收稿日期：2016-12-01 本文編輯：方菊花）