植物抗蟲基因工程的研究進展

劉一杰，薛永常

（大連工業大學生物工程學院，遼寧大連 116000）

?

植物抗蟲基因工程的研究進展

劉一杰，薛永常

（大連工業大學生物工程學院，遼寧大連 116000）

摘 要：綜述近年來植物抗蟲基因研究的主要進展，對植物抗蟲基因種類、目的基因來源及其編碼蛋白的抗蟲作用機理進行較為系統的闡述，介紹植物抗蟲基因的主要轉化方法，針對目前植物抗蟲基因研究中存在的主要問題提出相應的解決途徑，展望了植物抗蟲基因工程的未來發展方向。

關鍵詞：抗蟲基因；遺傳轉化；基因工程

文獻著錄格式:劉一杰，薛永常.植物抗蟲基因工程的研究進展［J］.浙江農業科學，2016，57（6）: 873-878.

近年來，蟲害作為我國農林減產的重要原因，越來越受到農林從業者的廣泛重視。根據聯合國糧農組織統計，全球每年因蟲害損失的糧食占世界糧食年總產量的14%左右，嚴重制約著世界農業經濟的發展。農作物蟲害除造成大量經濟損失外，還會直接導致農產品腐爛、霉變等，甚至產生對人體有毒有害的物質。我國目前治理蟲害的主要方法是噴施農藥或生物殺蟲劑，但此方法不僅造成嚴重的環境污染，導致害蟲的抗藥性增強，破壞植被低層生態平衡，而且農產品還會存在對人體有害的大量農藥殘留。因此，綠色高效的基因工程技術已成為當前植物抗蟲研究的重要途徑。在提高植物蟲害綠色防控技術，推動農藥使用量零增長等方面意義重大。

1 抗蟲基因種類及來源

1.1 源于微生物的抗蟲基因

1.1.1 Bt基因

蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiesis，Bt）的毒蛋白基因，簡稱Bt基因。在芽孢形成時，該基因編碼的δ-內毒素（δ-endotoxin），也稱殺蟲晶體蛋白或晶體毒素，對直翅目、膜翅目、鱗翅目、雙翅目、同翅目、鞘翅目和食蟲目等多種昆蟲以及原生動物、線蟲、螨等具有特異性的殺滅作用。殺蟲晶體蛋白（130～160 ku）自身沒有生物活性，當其被目標昆蟲攝食后，在昆蟲中腸的堿性環境下被胰蛋白酶水解并激活，形成毒素核心肽段（40～ 70 ku），與昆蟲中腸上皮細胞的刷狀緣膜上高親和受體結合，毒素核心肽段部分插入細胞磷脂雙分子層，使細胞膜允許離子（Na+，K+等）及寡糖（蔗糖或麥芽糖等）自由通過，影響細胞滲透壓，導致細胞裂解死亡，最終滅殺敏感昆蟲。

蘇云金芽孢桿菌中編碼殺蟲晶體蛋白的基因稱為晶體蛋白質基因，即Cry基因［1］。自1981年首條Cry基因被成功克隆測序以來［2］，截至2015年12月，已報道的Bt基因已經達到813種，其中Cry共775種，分屬74個群，Cyt共38種，分屬3個群（http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil-Crickmore/Bt/toxins2.html）。近幾年，對鞘翅目和鱗翅目具有特異性滅殺作用的殺蟲晶體蛋白（CryⅤ）以及對線蟲具有特異性滅殺作用的殺蟲晶體蛋白（CryⅥ）也相繼被發現。

1987年，世界上首例Bt轉基因抗蟲煙草和番茄植株分別培育成功［3-5］。但早期的轉Bt基因抗蟲植株抗蟲性普遍較低，殺蟲晶體蛋白的含量只占可溶性蛋白的1/1 000，遠遠達不到農林業生產種植的要求。1990年Perlak等［6］通過修飾Bt基因，使其在Bt轉基因棉花中的表達量大大提高，植株抗蟲性明顯增強，從而使Bt轉基因抗蟲技術在農林業中的應用成為可能。到目前為止，Bt基因已經成功轉入玉米、水稻、馬鈴薯、番茄等農作物以及楊樹、核桃、蘋果等經濟林木。我國已開始大面積種植Bt轉基因抗蟲作物，并在增產增收、降低農藥使用量方面獲得了顯著成效。

1.1.2 營養期殺蟲蛋白基因

營養期殺蟲蛋白（vegetative insecticidal proteins，VIPs）是一種新型高效的殺蟲毒蛋白。VIPs在蘇云金桿菌生長的對數期開始分泌在穩定前期達到最高。目前，VIPs主要由殺蟲作用機理不同的VIP1，VIP2和VIP3 3種毒蛋白組成。其中VIP1A分為VIP1A（a）和VIP1A（b）2類，VIP2A分為VIP2A（a）和VIP2A（b）2類。VIP1A（a）與VIP2A（a）構成二元毒素，對鞘翅目葉甲科昆蟲有特異性滅殺作用。編碼這2種蛋白的基因分別為vip1A和vip2A，約有12%的Bt中存在這2類基因［7］。VIP3A主要包括VIP3A（a），VIP3A（b）和VIP3A（c）。前2種蛋白對鱗翅目昆蟲有廣譜的滅殺活性，編碼蛋白的基因分別為vip3A（a）和vip3A（b）［8-9］。1996年Estruch等［10］發現并成功對vip3A（a）和vip3A（b）2組同源基因克隆測序。目前，VIP1和VIP22種毒蛋白未進行細胞病理學和免疫化學試驗，其對敏感昆蟲的滅殺作用機理也不了解。而VIP3對敏感昆蟲的滅殺作用機理研究已較為深入。通過細胞病理學研究表明，VIP3A蛋白滅殺敏感昆蟲的作用機理為VIP3A蛋白特異性的與昆蟲中腸內的微絨毛結合，誘發昆蟲細胞凋亡，導致細胞核溶解，最終殺滅敏感昆蟲，這與殺蟲晶體蛋白的作用機理完全不同［11］。2015年余曉嬌等［12］報道了BtNBIC-380菌株的vip3A（a）基因在枯草芽孢桿菌中表達的蛋白對棉鈴蟲具有滅殺活性。

1.1.3 分泌期殺蟲蛋白基因

分泌期殺蟲蛋白（secreted insecticidal protein，Sip），作為蘇云金芽孢桿菌分泌的一種新型的殺蟲蛋白，目前對其研究還比較少。對敏感昆蟲的滅殺作用機理也沒有相關的報道。但作為Bt殺蟲毒蛋白的重要組成部分，研究者們已經開始對其進行相關的研究并取得了部分成果。2012年劉艷杰等［13］從編號為QZL26的Bt野生菌株中成功克隆得到1 038 bp的堿基序列，生物信息學分析表明，其編碼的345個氨基酸與Sip1A氨基酸序列同源性達91.83%。2015年張金波等［14］從編號為DQ89的Bt菌株中成功提取并克隆得到sip基因（1 188 bp），并在大腸桿菌中完成表達。生測結果顯示，由該基因編碼的蛋白對鞘翅目葉甲科的大猿葉甲具有滅殺活性。針對目前昆蟲抗性增強，新型毒蛋白基因的研究意義重大。

1.1.4 源于其他微生物的抗蟲基因

異戊烯基轉移酶（isopentenyltransferases，IPT）是細胞分裂素合成中的關鍵酶。將根癌土壤桿菌的IPT基因導入煙草、番茄中表達后，可明顯減少煙草夜蛾對植株的損傷。但是，IPT基因的表達會影響植物生長發育。

作為第二代抗蟲基因膽固醇氧化酶基因，廣泛存在于鏈霉菌屬、紅球菌屬、假單胞菌屬和短桿菌屬等細菌中。其編碼的膽固醇氧化酶對敏感昆蟲有滅殺活性，將其基因導入煙草和番茄后發現，轉基因植株可以有效抵御煙草夜蛾的危害［15］。膽固醇氧化酶是膽固醇代謝過程中的關鍵酶，其對敏感昆蟲的滅殺作用機理是催化分解昆蟲體內膽固醇，產生17-酮類固醇與過氧化氫，進而導致昆蟲中腸細胞溶胞死亡，最終滅殺昆蟲。研究表明，膽固醇氧化酶對棉鈴象甲及煙草夜蛾等直翅目、鱗翅目、鞘翅目、同翅目和雙翅目的敏感昆蟲均有滅殺活性［16］。作為一種寬譜殺蟲基因，其可以有效彌補Bt基因抗蟲譜的不足。目前，國內對該基因的研究報道較少［17］。

1.2 源于植物的抗蟲基因

1.2.1 蛋白酶抑制劑基因

蛋白酶抑制劑（proteaseinhibitor，PI）是一種主要存在于植物塊莖、種子等儲藏器官中低分子量的多肽或蛋白質。該抑制劑的基因編碼區較短，一般沒有內含子。PI對植物許多重要的生命活動均有調節作用，經研究發現，其對部分敏感昆蟲有滅殺活性。1987年Hilder等［18］首次成功培育了轉豇豆蛋白酶抑制劑基因的抗蟲煙草植株，使蛋白酶抑制劑基因在植物抗蟲基因工程方向應用成為可能。蛋白酶抑制劑基因對敏感昆蟲的滅殺作用機理是蛋白酶抑制劑被敏感昆蟲侵食后，會與其消化道內的蛋白消化酶結合，抑制其活性，導致昆蟲體內蛋白消化酶過量分泌，影響昆蟲消化作用，最終導致昆蟲死亡。植物蛋白酶抑制劑根據與酶結合的活性位點不同分為絲氨酸蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑和金屬羧肽酶蛋白酶抑制劑3類。前2種對敏感昆蟲的滅殺作用明顯，相比于其他抗蟲基因（如Bt基因，凝聚素基因等）具有抗蟲譜廣、敏感昆蟲不易產生耐受性、不污染環境和生物安全性高等優點，因而被廣泛研究［19］。

目前蛋白酶抑制劑基因抗蟲技術已廣泛應用于玉米、棉花等農作物，并取得了較大進展。2015年王江英等［20］成功克隆杜鵑紅山茶半胱氨酸蛋白酶抑制劑（CaCPI）基因轉入煙草植株并實現過量表達，研究結果顯示，轉CaCPI基因的煙草植株對蚜蟲的滅殺活性明顯提高，接蟲5 d后蚜蟲累計死亡率達90.75%。

1.2.2 a-淀粉酶抑制劑基因

a-淀粉酶抑制劑基因是一種植物中普遍存在的基因，豆科植物和禾谷類植物的儲藏器官中均含有較為豐富的該基因。a-淀粉酶抑制劑基因在植物對抗病蟲害侵染的天然防御系統中至關重要［21］。a-淀粉酶抑制劑基因對敏感昆蟲的滅殺作用機理是該基因表達的a-淀粉酶抑制劑與敏感昆蟲消化道內a-淀粉酶1∶1結合，有效抑制其活性，阻斷淀粉的水解反應，使昆蟲體內能量供給不足，通過刺激昆蟲生理反饋調節系統，導致昆蟲體內消化酶過量分泌，產生厭食反應，最終導致昆蟲死亡［22］。2009年王曉婧等［23］成功克隆了a-淀粉酶抑制劑基因sai （360 bp）并完成原核表達，實驗結果顯示，該基因表達的a-淀粉酶抑制劑能有效抑制棉鈴蟲體內a-淀粉酶活性及其幼蟲的生長發育，而對小麥種子內的a-淀粉酶活性沒有影響。2015年Bahagiawati等［24］研究了轉基因小麥中a-淀粉酶抑制劑與半胱氨酸蛋白酶抑制劑的協同作用可以有效減緩四紋豆象的生長發育。

1.2.3 植物凝聚素基因

植物凝聚素是一種活性蛋白，它具有一個或多個可與單糖或寡糖可逆性結合的非催化結構域，這種結合不會改變糖基的共價結構。研究發現，植物凝聚素對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目和同翅目等昆蟲具有滅殺活性。由于缺乏相關研究，其對昆蟲的滅殺作用機理目前尚不明確，一般認為植物凝聚素是通過與昆蟲消化道內糖蛋白，如昆蟲中腸紋緣膜細胞、圍食膜表面或糖基化的消化酶等結合，阻礙昆蟲的營養吸收，抑制其生長發育，最終滅殺昆蟲。植物凝聚素在植物界廣泛分布，植物種子和營養器官中的含量最為豐富。

菜豆凝集素是第一種被報道具有抗蟲作用的植物凝集素，但是其對豆象幼蟲具有滅殺活性的結論是基于一個錯誤的實驗結果，1991年Huesing等［25］發現這種滅殺活性是由于含有a-淀粉酶抑制劑的緣故。目前，植物凝聚素基因已成功應用于植物抗蟲基因領域，如雪花蓮凝聚素基因［26］、豌豆凝聚素基因［27］、半夏凝聚素基因［28］和麥胚凝聚素基因等。雖然植物凝聚素基因對敏感昆蟲滅殺活性顯著，但部分植物凝聚素如麥胚凝聚素對哺乳動物同樣存在毒性，而雪花蓮凝聚素和豌豆凝聚素對哺乳動物毒性較小，是抗蟲基因工程的重點研究方向。目前雪花蓮凝聚素已成功轉入水稻、馬鈴薯、葡萄、甘蔗、番茄、油菜、煙草、向日葵等經濟作物，均表現出較好的抗蟲性［29］。1999年毛雪等［30］通過生測明確鑒定了棉花凝聚素、天南星凝聚素、蓖麻凝聚素以及伴刀豆凝聚素對棉蚜和麥長管蚜的滅殺活性。2015年高勇等［31］對半夏凝聚素結構進行了分析和分子模擬，同年，崔彥芹等［32］成功將半夏凝聚素基因pta導入水稻，并獲得相應的轉基因陽性植株。

1.2.4 源于植物的其他種類抗蟲基因

研究發現植物中提取的核糖體滅活蛋白、幾丁質酶、色氨酸脫羥酶、番茄素、過氧化物酶和豌豆脂肪氧化酶、多酚氧化酶、脂氧化酶等都對敏感昆蟲有滅殺活性。這幾種酶雖然表現出了不同的抗蟲效果，但其對敏感昆蟲的滅殺機理尚不明確，抗蟲譜及生物安全性還有待實驗驗證。

1.3 源于昆蟲自身的抗蟲基因

昆蟲神經激素是影響昆蟲生長、繁殖、變態、代謝和行為等生命活動的重要因素。近幾年，研究者已將昆蟲神經激素應用到蟲害防治中來。但轉昆蟲神經激素基因抗蟲植物的研究還相對較少。1996年姚斌等［33］成功將改造后的昆蟲特異性神經毒素AalT基因轉入煙草中并表達，獲得了對棉鈴蟲有滅殺活性的抗蟲植株。1999年毛利群等［34］成功將昆蟲特異性神經毒素基因tox34改造后轉入煙草并表達，生測結果顯示，該植株對棉鈴蟲的幼蟲有很好的滅殺活性。此外，蝎β型昆蟲毒素對部分敏感昆蟲有明顯的滅殺活性［35］。

2 植物抗蟲基因的遺傳轉化方法

植物基因工程研究過程中，將外源基因導入植物受體細胞，使之發生永久性的定向遺傳變異是其關鍵步驟之一。經過研究者的不斷探索，目前發展比較成熟的植物基因遺傳轉化方法主要有:農桿菌介導法、基因槍法、顯微注射法、電擊法、聚乙二醇法、花粉管通道法、激光法等多種方法。其中，農桿菌介導法和基因槍法是目前應用最廣泛的2種方法。

2.1 農桿菌介導法

農桿菌中存在一種染色體外自主復制的雙鏈環狀DNA分子，簡稱Ti質粒。這段環形雙鏈DNA分子上包含可轉移DNA區（T-DNA）、結合轉移區、毒性區和復制起始區四部分。其中T-DNA可將外源基因導入植物受體細胞，使其攜帶的目的基因完成表達，并利用植物細胞全能性，通過組織培養獲得完整轉基因植株，這種方法叫作農桿菌介導法。此方法利用天然存在的植物基因遺傳轉化體系，通過基因工程手段達到轉基因的目的。農桿菌介導法與其他方法相比具有操作簡單、技術成熟、轉化效率高、培養周期短、基因沉默現象少、穩定表達性好等諸多優點，此方法還可將大段DNA片段完整轉入植物細胞中，因此應用最為廣泛。但是此方法也有不足之處，由于T-DNA可以在植物基因的任何區域插入，有可能導致有益基因失活，目前主要用于雙子葉植物基因的遺傳轉化，在禾本科植物方面的應用仍存在諸多局限［36］。

2.2 基因槍法

基因槍法，又稱基因槍轟擊技術。其原理是將表面附著核酸分子的金屬（金、鎢等）微粒通過高壓噴射導入受體細胞，使外源基因與受體細胞的基因整合表達的過程。這種方法是1987年由康奈爾大學的Sanford等［37］提出的一種直接將外源基因導入受體細胞的物理方法。所用惰性金屬微粒不影響植物細胞正常的生理活動。這種方法具有操作簡便、無宿主限制、獲得轉基因植株的周期短、可控性高等優點，因此成為除農桿菌介導法外最為常用的方法。但此方法也有自身的缺點，如轉化效率低、容易出現基因沉默和費用較高等。

2.3 聚乙二醇法

聚乙二醇法，也稱PEG法。其原理是使用聚乙二醇、多聚-L-鳥氨酸、磷酸鈣等高pH值的化學試劑處理去壁的原生質體作為轉化受體，通過改變細胞膜通透性使外源DNA分子進入受體細胞完成遺傳轉化的一種化學方法。這種方法因重復性好、結果較穩定、成本低等優點在發明初期被廣泛應用，但此方法由于存在原生質體培養難度大、轉化效率低、易受基因型限制等明顯的缺點，因此植物抗蟲基因工程方面應用較少。

2.4 顯微注射法

顯微注射法是一種使用顯微注射器將遺傳物質直接導入受體細胞，再通過組織培養獲得轉基因植株的方法。此方法具有基因導入準確，克服遠緣雜交困難等優點，但由于其操作難度大、工作效率低、表達不穩定等缺點，自基因槍法出現以來，該方法在植物轉基因工程方面逐漸被替代，此方法在動物基因工程方面仍被廣泛應用。

2.5 電擊法與激光法

電擊法的原理是在高壓電脈沖下，原生質體質膜會出現瞬時可逆的小孔，外源基因可從小孔進入原生質體完成基因轉化，通過后期培養獲得轉基因植株。激光法與電擊法相似，原理是用固定波長的激光束聚焦后打在受體細胞表面，引起細胞膜瞬時可逆性穿孔，外源基因從小孔進入受體細胞完成基因轉化，經培養后得到完整轉基因植株。這2種方法的優點是對受體細胞無毒、受體材料廣泛、轉化效率高、可用于瞬間表達等。但由于操作復雜，容易對受體細胞造成物理性損傷，因此發展較為緩慢。

2.6 花粉管通道法

花粉管通道法，也稱子房注射法，是利用植物有性生殖受精過程中，花粉管形成的從外界到達子房的通道，將外源基因注入胚囊，轉化未形成正常細胞壁的卵子、合子或早期胚胎細胞的方法。這種方法免除組織培養的復雜過程，直接獲得轉化后的植株種子，是一種在活體植株上完成基因轉化的新途徑。這種外源基因導入技術是由周光宇等［38］建立并發展起來的。目前國內種植面積最廣的轉基因抗蟲棉就是用這種方法培育的。此方法的優點有易操作、可在活體植株上完成基因轉化、受體材料廣泛等。但其也有一定的缺陷，如轉化效率較低，植株受精時間及規律難以控制，外源DNA的結構、濃度及大小對轉化結果影響較大等。除此之外，植物基因的遺傳轉化方法還有很多。在研究過程中，除了選擇適合研究對象的單一轉化方法外，還可以多種方法結合使用，實現基因轉化方法的優缺點互補。

3 存在問題及應對措施

3.1 外源基因的表達量低

一般而言，抗蟲基因的表達量與抗蟲效果正相關。抗蟲基因表達量不高是實驗過程中普遍存在的問題［39］。目前減少此問題的方法:選擇與受體植物同源性較低的基因，盡量篩選單拷貝個體，避免多拷貝外源基因造成的“基因沉默”現象；采用植物中相應的啟動子和增強子構建嵌合基因進行調控；利用基質結合區提高基因表達量；采用葉綠體轉化；在載體上嵌入去甲基化基因序列防止甲基化等。

3.2 昆蟲抗性增強

昆蟲抗性是植物抗蟲轉基因工程中存在的嚴重問題，目前抗蟲基因已廣泛應用于農林業生產中，昆蟲抗性問題也隨之顯現［40］。目前，為了避免或延緩敏感昆蟲的抗性，主要有以下幾種方法:同時應用2種或多種抗蟲基因，不僅可有效提高抗蟲性，還可拓寬抗蟲譜［41］；選擇特異的啟動子和損傷誘導啟動子，減少殺蟲時間，盡量縮短敏感昆蟲的適應期［42］；建立避難所等［43］。

3.3 生態風險性

每一種新型轉基因抗蟲植株的引入，都會對其所處生物群落的結構和功能產生影響。短時間內可能會造成某一物種種群數量的急劇下降，降低生物多樣性，破壞生態系統原有的平衡。還有可能引起目標害蟲向其他宿主的遷移，對其天敵的種群數量產生影響。如，墨西哥玉米污染事件和Bt轉基因玉米對美國黑脈金斑蝶負面影響事件等。此外，轉基因植株與其他野生植株雜交，引起基因漂移，可能會產生競爭力更強的有害物種，如加拿大抗除草劑油菜事件。目前，對于轉基因植物的生態風險還沒有具體的解決辦法，我國的生物安全研究也多是從生物技術應用角度出發，因此，建立完備的轉基因抗蟲植株生態風險防控體系，也是今后轉植物抗蟲基因工程研究的重要方向。

4 展望

植物抗蟲基因工程在30多年的發展歷程中已經取得了豐碩的科研成果，轉基因抗蟲棉花、玉米、水稻、番茄、馬鈴薯和楊樹等在農林業的廣泛種植，說明這項技術在逐步走向成熟。探索新型高效的抗蟲基因、明確其抗蟲機制，增強抗蟲基因的遺傳表達穩定性，發展新型基因導入技術，采用多種方法避免或減緩敏感昆蟲抗性，完善轉基因抗蟲植株的生態安全保障措施等，將是植物抗蟲基因工程未來的發展方向。

雖然目前植物抗蟲基因工程各方面還存在諸多問題，但隨著新理論、新技術、新方法的不斷完善，將會有更多新型優良的抗蟲作物從實驗室走向大田。在未來的發展中，植物抗蟲基因工程必定會在提高植物蟲害綠色防控，推動農藥使用量零增長等方面做出巨大貢獻。

參考文獻:

［1］ SCHNEPFE，CRICKMORE N，VAN R J，etal.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins［J］.Microbiology& MolecularBiologyReviews，1998，62（3）: 775-806.

［2］ SCHNEPFHE，WHITELEYH R.Cloningand expression of theBacillusthuringiensiscrystalprotein genein Escherichia coli ［J］.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesofthe United StatesofAmerica，1981，78（5）: 2893-2897.

［3］ FISCHHOFFDA，BOWDISHKS，PERLAKFJ，etal.Insect toleranttransgenictomatoplants［J］.Biotechnology，1987，5 （8）: 807-813.

［4］ HILDERVA，GATEHOUSEAMR，SHEERMANS E，etal.Anovelmechanismofinsectresistanceengineered intotobacco ［J］.Nature，1987，330（6144）: 160-163.

［5］ BARTON K A，WHITELEY H R，YANG N S.Bacillus thuringiensis-Endotoxin expressed in transgenic Nicotiana tabacumprovidesresistancetolepidopteran insects［J］.Plant Physiology，1988，85（4）: 1103-1109.

［6］ PERLAKFJ，DEATON R W，ARMSTRONG TA，etal.Insectresistantcotton plants［J］.Bio/technology，1990，8 （10）: 939-943.

［7］ WARREN G W，KOZIEL M G，MULLINS M A，etal.Auxiliaryproteinsforenhancingtheinsecticidalactivityof pesticidalproteins: US，US5770696［P］.1998-06-23.

［8］ RICE W C.Specific primersforthe detection ofvip3A insecticidalgenewithin aBacillusthuringiensiscollection［J］.Lettersin Applied Microbiology，1999，28（5）: 378-382.

［9］ ESTRUCH JJ，YU C G，WARREN GW，etal.Classof proteinsforthecontrolofplantpests: US，US5877012［P］.1999-03-02.

［10］ ESTRUCH JJ，WARREN G W，MULLINS M A，etal.Vip3A，anovelBacillusthuringiensisvegetativeinsecticidal protein with awidespectrum ofactivitiesagainstlepidopteran insects［J］.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesof theUnited StatesofAmerica，1996，93（11）: 5389-5394.

［11］ JACOBSONM D，WEILM，RAFFM C.Programmed cell death in animaldevelopment［J］.Cell，1997，88（3）: 347-354.

［12］ 余曉嬌，劉曉艷，楊自文.蘇云金芽胞桿菌NBIC-380菌株營養期殺蟲蛋白3Aa基因（vip3Aa）在大腸桿菌及芽胞桿菌中的表達［J］.農業生物技術學報，2015，23（11）: 1465-1471.

［13］ 劉艷杰，李海濤，劉榮梅，等.Bt新型基因sip的克隆、表達和生物信息學分析［J］.生物技術通報，2012（12）: 101-105.

［14］ 張金波，李海濤，劉榮梅，等.Bt菌株DQ89的sip基因的克隆、表達及殺蟲活性分析［J］.中國生物防治學報，2015，31（4）: 598-602.

［15］ CAROZZINB，KOZIELM G.Advancesin insectcontrol: the roleoftransgenicplants［M］.CRCPress，1997.

［16］ MASOUDS A，JOHNSONLB，WHITEFF，etal.Expression ofacysteineproteinaseinhibitor（oryzacystatin-I）in transgenic tobaccoplants［J］.PlantMolecularBiology，1993，21（4）: 655-663.

［17］ 張玲.短桿菌膽固醇氧化酶基因的表達研究［D］.無錫:江南大學，2008.

［18］ HILDERVA，GATEHOUSEAMR，SHEERMANS E，etal.Anovelmechanismofinsectresistanceengineered intotobacco ［J］.Nature，1987，330（6144）: 160-163.

［19］ 孫姣姣.棉鈴蟲Serpin基因的克隆、表達及FeedingRNAi分析［D］.保定:河北大學，2015.

［20］ 王江英，范正琪，殷恒福，等.杜鵑紅山茶CaCPI基因的克隆及過量表達提高煙草植株的抗蟲性［J］.華北農學報，2015，30（5）: 57-64.

［21］ RICHARDSONM.Seed storageproteins: theenzymeinhibitors ［J］.Methodsin PlantBiochemistry，1991，5: 259-305.

［22］ 王琳.昆蟲淀粉酶抑制劑的研究進展［J］.中國農學通報，2006，22（8）: 397-400.

［23］ 王曉婧.a-淀粉酶抑制因子基因sai的克隆、表達及生物活性研究［D］.北京:中國農業科學院，2009.

［24］ AMIRHUSINB，SHADERE，KOIWAH，etal.Soyacystatin N inhibits proteolysis of wheat a-amylase inhibitor and potentiatestoxicity againstcowpeaweevil［J］.Journalof EconomicEntomology，2015，96（7）: 2095-2100.

［25］ HUESINGJE，SHADER E，CHRISPEELS M J，etal.a-Amylaseinhibitor，notphytohemagglutinin，explainsresistance ofcommon bean seedstocowpeaweevil［J］.PlantPhysiology，1991，96（3）: 993-996.

［26］ 李陳建，買寅生，付彥博，等.轉sGNA基因小麥農藝性狀評價與抗蚜效果分析［J］.新疆農業科學，2015，52（3）: 503-510.

［27］ 郭佩佩.大豆凝集素基因lec-s的克隆及轉化煙草的研究［D］.南京:南京農業大學，2012.

［28］ 張正英，李淑潔，李靜雯，等.西和半夏凝集素抗蟲基因克隆及對棉花的遺傳轉化［J］.分子植物育種，2012，10 （5）: 546-550.

［29］ 崔興國.植物凝集素在抗病蟲害中的應用［J］.農業科技與裝備，2012（12）: 8-9.

［30］ 毛雪，高麗峰.植物凝集素對蚜蟲的抗生效應［J］.山西農業大學學報（自然科學版），1999（2）: 122-124.

［31］ 高永，楊支力，李東海，等.半夏凝集素結構預測分析［J］.浙江理工大學學報（自然科學版），2015，33（2）: 269-275.

［32］ 崔彥芹，李尚偉，張麗萍，等.半夏凝集素基因在水稻中的轉化及篩選［J］.西南農業學報，2015，28（4）: 1419-1422.

［33］ 姚斌，范云六，曾勤，等.表達昆蟲特異性神經毒素AaIT基因的轉基因煙草的抗蟲性［J］.生物工程學報，1996，12（2）: 113-118.

［34］ 毛立群，郭三堆.昆蟲特異性神經毒素基因tox34的合成及轉基因煙草的獲得［J］.植物學報，1999，41（11）: 1208-1211.

［35］ 付月君，趙潔，梁愛華.蝎β型昆蟲毒素的結構及其與鈉通道作用機制［J］.中國生物化學與分子生物學報，2014 （2）: 125-131.

［36］ 崔廣榮.植物轉基因方法及特點和轉基因沉默現象［J］.安徽技術師范學院學報，2003，17（1）: 37-41.

［37］ SANFORDJC，SMITH FD，RUSSELLJA.Optimizingthe biolisticprocess fordifferentbiologicalapplications［J］.Methodsin Enzymology，1993，217（1）: 483-509.

［38］ 周光宇，龔蓁蓁，王自芬.遠緣雜交的分子基礎——DNA片段雜交假設的一個論證［J］.遺傳學報，1979，6（4）: 405-413.

［39］ 劉冬艷，張斌，曹楊宇，等.轉抗蟲基因楊樹外源基因表達的研究進展［J］.河北林果研究，2015，30（3）: 243-247.

［40］ 鄭慶偉.南京農業大學在棉鈴蟲對Bt棉花抗性研究方面取得重要進展［J］.農藥市場信息，2015（2）: 54.

［41］ 張啟軍，顏文飛，夏士健，等.農桿菌介導的針刺法將雙價抗蟲基因導入水稻［J］.江西農業學報，2015，27（8）: 6-9.

［42］ DATTAK，VASQUEZA，TUJ，etal.Constitutiveand tissuespecificdifferentialexpression ofthe cryIA（b）gene in transgenicriceplantsconferringresistancetoriceinsectpest ［J］.Theoretical& Applied Genetics，1998，97（1/2）: 20-30.

［43］ HUANGF，ANDOW DA，BUSCHMANLL.Successofthe high-dose/refugeresistancemanagementstrategyafter15yearsof Btcrop usein North America［J］.EntomologiaExperimentalis EtApplicata，2011，140（1）: 1-16.

（責任編輯：張 韻）

中圖分類號：Q943.2

文獻標志碼：A

文章編號：0528-9017（2016）06-0873-06

DOI：10.16178/j.issn.0528-9017.20160624

收稿日期:2016-01-04

作者簡介:劉一杰（1990—），女，河北承德人，碩士研究生，研究方向為分子生物學，E-mail: liuyi-1990@163.com。

通信作者:薛永常（1966—），男，教授，博士，研究方向為分子生物學，E-mail: xueych@dlpu.edu.cn。