蓋他病毒的診斷及研究進展

鄒云婧，梁中銀，張 姍，鄭英帥，袁萬哲,4,5*，孫繼國,4,5*

（1．河北農業大學動物醫學院，河北 保定 071001；2．河北農業大學動物科技學院，河北 保定 071001；3．天津市動物衛生監督所，天津 300211；4．河北省獸醫生物技術工程技術研究中心， 河北 保定 071001；5．農業部動物疫病病原生物學華北區觀測實驗站，河北 保定 071001）

蓋他病毒的診斷及研究進展

鄒云婧1，梁中銀2，張 姍1，鄭英帥3，袁萬哲1,4,5*，孫繼國1,4,5*

（1．河北農業大學動物醫學院，河北 保定 071001；2．河北農業大學動物科技學院，河北 保定 071001；3．天津市動物衛生監督所，天津 300211；4．河北省獸醫生物技術工程技術研究中心， 河北 保定 071001；5．農業部動物疫病病原生物學華北區觀測實驗站，河北 保定 071001）

蓋他病（Getah，GET）是由披膜病毒科甲病毒屬的蓋他病毒（Getah virus，GETV）引起的主要侵害豬和馬的一種蟲媒傳染病。蓋他病毒可引起母豬繁殖障礙，導致妊娠母豬流產、產死胎或弱仔。該病毒在亞洲地區、澳大利亞北太平洋沿岸地區分布廣泛，給家畜和養殖業帶來了一定威脅。目前，針對蓋他病毒的研究還較少，為此，筆者概述了蓋他病毒的發現和分類、分子生物學特征、流行病學及臨床癥狀、診斷技術等，擬為該病的深入研究提供相關的理論參考。

蓋他病毒；分子生物學特性；流行病學及臨床癥狀；診斷技術

蓋他病毒為單鏈線形RNA，是披膜病毒科甲病毒屬的一個重要成員。蓋他病是由蓋他病毒引起的一種蟲媒傳染病，與人畜關系密切。病毒可通過蚊子傳播感染脊椎動物，主要侵害豬和馬，如造成母豬繁殖障礙，妊娠母豬流產、產死胎或弱仔，并能引起馬的發熱、皮疹、后腿浮腫、淋巴結腫大等，同時還可感染鳥類、鼠類、爬行和兩棲動物。該病毒廣泛分布于亞洲和北太平洋沿岸地區，如馬來西亞、中國、日本、韓國、菲律賓、泰國、澳大利亞等[1-3]，被列為重要的動物源性病原體[4-6]。但目前，針對蓋他病毒的研究在國內還較少，很多機理也有待于進一步探索。為了更好地了解和掌握蓋他病毒相關知識，本文對該病毒的發現及分類、分子生物學特性、流行病學及臨床癥狀、診斷技術等方面加以綜述，以為今后對蓋他病毒的進一步研究和完善人畜共患病公共衛生體系及預警機制提供一定理論參考。

1 病毒的發現及分類

蓋他病毒于1956年首次在馬來西亞從雪背庫蚊（C.gelidus）體內分離到，命名為Getah virus，原型株為MM2021[7]。此后，在日本、前蘇聯東部、東南亞及澳大利亞也相繼分離到此病毒[8]。自病毒被發現以來，其對人和動物的傳染性與致病性引起了諸多學者的關注。研究顯示，在我國很多地區也有蓋他病毒的分布[9]。目前，我國已經分離到的蓋他病毒病原體有10株，分別為：1964年，在海南省捕捉的庫蚊中分離到1株病毒，命名為M1，經鑒定為GETV[10]；王煥琴等在對河北省蚊蟲進行病毒分離鑒定時發現2個毒株屬于甲病毒屬成員，用甲病毒屬特異性引物進行RT-PCR擴增，結果呈陽性，經核酸序列測定證實從河北省蚊蟲標本中分離到GETV（HB0234，HB0215），這也是首次在我國內陸地區分離到該病毒[11]；2005年，從云南省分離到GETV 2株（YN0540，YN0542）；同年，在上海分離到GETV 4株(SH05-5、SH05-15、SH05-16、SH05-17)[9]；2006年，翟友剛等在甘肅省吸血蚊蟲中分離到1株GETV（GS10-2）[12]。近年來，在我國多數地區，豬蓋他病毒抗體陽性率水平呈持續上升趨勢，夏季尤為嚴重[13]。

2 病毒的分子生物學特征

2．1 形態結構與理化特性

蓋他病毒為單鏈線形RNA，病毒顆粒呈球形，直徑為60～70 nm，具有囊膜和纖突，有典型的甲病毒屬基因組結構，包括糖蛋白外殼、雙層類脂膜及含有RNA的核心3個基本組成成分[8]。病毒對酸（pH3.0）、堿及有機溶劑（乙醚、氯仿等）敏感[14]；在1 mol/L的MgCI2狀態下，對50 ℃以上溫度敏感性較強，病毒在10 ℃環境中可存活3個月，4 ℃時毒力可保留6個月。GETV對4日齡以下的小白鼠具有病原性，病毒可在各種脊椎動物和節肢動物體內增殖，且能凝集鵝、雞、馬、鼠、兔等動物的紅細胞。對Vero、BHK-21等細胞系易感。

2．2 基因組與編碼蛋白

病毒的基因組為單鏈線形RNA，長度在11～12 kb之間，具有5' 帽子結構和3' 多聚腺苷酸（Poly A）尾。其中，3' Poly（A）尾的存在與其RNA具有感染性直接相關。基因組可分為兩個不同的區段，包括非結構區和結構區。前者位于基因組5’端前2/3部分， 含有7 600個核苷酸，負責編碼nsP1、nsP2、nsP3和nsP4 4種非結構蛋白，主要為病毒自身復制酶，與病毒自身轉錄和復制有關；后者位于基因組3’末端后1/3部分，含有4 100個核苷酸，用于編碼多種結構蛋白如衣殼蛋白C、外膜糖蛋白E1、E2、E3和6K蛋白等[8,15-16]，3’UTR末端19 nt保守序列與病毒的復制和存活密切相關，為病毒存活所必需[17]。

2．3 保守區核苷酸序列

在甲病毒基因組核苷酸序列中均具有4個完全相同的序列區，稱序列保守區[18]。通常來說，序列越保守，功能就相對越重要。基因組5’端帽子結構后44個核苷酸圍成一個帶柄的環帶，稱為第一保守區，具有啟動子的功能，負責在病毒基因組復制過程中負鏈RNA的合成；緊連第1保守區為第2保守區，由51個核苷酸組成，這些核苷酸形成與第1保守區相似的柄狀環，功能尚不清楚；在基因組49S與26SmRNA的接合部，由24個核苷酸組成第3保守區（連接部位保守序列）；第4保守區位于基因組3’末端，其后為 Poly（A）尾，由 19 個核苷酸組成，因而也稱19 核苷酸保守區。到目前為止，由于以上4個保守區序列僅在甲病毒基因組中被發現，與其他種屬病毒的保守序列無交叉，因此，這些保守區核苷酸序列成為鑒定甲病毒的有力的依據和指標。

3 流行病學及臨床癥狀

蓋他病毒可對多種動物造成良性耐受且具有自我限制性的疾病。傳播媒介隨氣候和地理的變化而改變，蚊類尤其是刺擾伊蚊（Aedes vexans）和三帶喙庫蚊（Culex tritaeniorh ynchus）為其主要傳播媒介[3]。病毒能在媒介昆蟲體內或培養的昆蟲細胞中增殖，在自然宿主中主要表現為高滴度病毒血癥或無任何癥狀，但經蚊蟲傳播給人或動物后，可引起病毒病的流行。豬和馬是其主要宿主，且豬更為易感。豬感染該病具有明顯的季節性，主要以2-10月多發，4月份陽性率開始上升，在病毒蚊蟲媒介較多的7-9月達到高峰。GETV具有垂直傳播的特性，可經胎盤感染傳遞給子代，因此，本病毒是導致初生仔豬死亡的重要原因之一。

GETV可引起豬的疾病，病豬癥狀表現為精神不振、食欲減退或消失、全身震顫、體溫升高、腹瀉、體表發紅、共濟失調等，嚴重者還可出現神經癥狀，甚至衰竭死亡。懷孕母豬感染蓋他病毒后一般不出現臨床癥狀，但會引起繁殖障礙，導致胚胎死亡并被吸收，從而降低母豬產仔數；妊娠前期感染該病毒可導致胚胎死亡，母豬返情，產死胎等。對腦、肺、腎、腸等病變組織進行病毒分離及血清學鑒定，結果為GETV陽性，并能在ESK細胞中出現細胞病變（CPE）作用，對無菌豬肌肉注射，其人工感染結果與自然發病病例相同，證明本病毒對豬具有感染性和致病性。

4 診斷方法

4．1 血清學檢驗

血清學檢驗技術以抗原抗體反應為基礎，包括酶聯免疫吸附技術（ELISA）、血凝抑制、血清中和試驗(NT)、免疫熒光技術等多種血清學試驗均可對GETV的抗原及抗體進行鑒定及診斷[15]。該檢測方法靈活性大，在快速鑒定應用等方面優勢較明顯。

4.1.1 酶聯免疫吸附技術 酶聯免

疫吸附技術（ELISA）是一種用酶標記抗原或抗體的方法，即將抗原、抗體免疫反應的特異性和酶的高效催化作用原理有機地結合起來的技術，可敏感地檢測體液中微量的特異性抗原或抗體，具有靈敏、快速、簡便、經濟等優勢，尤其適用于大批量樣品檢測，是應用最廣的免疫學技術。

4.1.2 間接血凝抑制試驗 隨著我國規模化養豬業的發展，人們對GETV的診斷提出了更高的要求，但由于客觀條件所限，一些對于技術要求較高的診斷方法還較難普及運用，相比之下，血凝抑制試驗具有方便、快捷的特點，實用性較高。

4.1.3 血清中和試驗 中和試驗(NT)是將抗體與毒素或病毒相結合，從而導致毒素失去毒性或者病毒失去傳染力的一種免疫學試驗。試驗多采用細胞培養，具有方便、經濟等特點。中和抗體具有高特異性，且可維持較長時間。目前，應用最廣泛的是免疫熒光中和試驗，具體操作是在定量病毒中加入不同稀釋度的血清。

4.1.4 免疫熒光技術 免疫熒光技術包括直接免疫熒光和間接免疫熒光2種方法。該方法優點是快速、敏感、特異，與放射免疫法相比，熒光免疫法無放射性污染，并且易于操作，便于推廣；缺點是成本較高。

4.1.5 瓊脂擴散試驗 瓊脂擴散試驗為可溶性抗原與相應抗體在含有電解質的半固體凝膠(瓊脂或瓊脂糖)中進行的一種沉淀試驗，即可溶性抗原與相應抗體特異性結合，兩者在比例適當并有電解質存在及一定的溫度條件下，經一定的時間，可形成肉眼可見的沉淀物。該法操作簡單，但敏感性較差。

4．2 分子生物學技術

4.2.1 RT-PCR技術 RT-PCR又稱逆轉錄PCR，是將RNA的逆轉錄（RT）與cDNA的聚合酶鏈式擴增反應（PCR）相結合的技術。其原理是根據病毒DNA序列，設計特異性引物來擴增樣品中待檢測病毒的DNA片段，再通過電泳、染色把它顯示出來。RTPCR技術高效、靈敏、特異，用途廣泛。該方法可用于檢測細胞/組織中基因表達水平、細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。

4.2.2 用熒光蛋白基因構建復制子缺損的表達載體進行瞬時表達分析梁國棟[19]等利用此法，通過構建出的的質粒來對用來蓋他病毒進行定性或定量檢測分析[20]。

5 展望

目前，對蓋他病毒的研究仍較有限，很多機制機理尚不清楚，其危害及影響程度亦不可預知。而近年來，在我國多數地區的蚊蟲中相繼分離到GETV，因此，有必要對GETV加強研究力度，明確其發病機理，診治及防控方法，同時建立完善的GETV乃至其他蟲媒病毒的監測系統，加強對GETV的分離、基因特性及毒株抗原性研究，以便制備有效疫苗，對其危害作出評估，為科學防控GET提供依據。

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鄒云婧（1990-），女，碩士研究生，研究方向為預防獸醫學，E-mail:yunjingzouz@163.com

袁萬哲（1978-），男，副教授，博士，E-mail: yuanwanzhe@126.com

孫繼國（1956-），男，教授，博士，博士生導師，E-mail: vaccine2000@126.com