Th17及調節(jié)性T細胞及相關因子在頸動脈粥樣硬化發(fā)生過程中的作用及其機制

郭三強　韓升波　李　敏

(鄭州市中醫(yī)院心內科，河南　鄭州　450007)

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Th17及調節(jié)性T細胞及相關因子在頸動脈粥樣硬化發(fā)生過程中的作用及其機制

郭三強韓升波1李敏2

(鄭州市中醫(yī)院心內科，河南鄭州450007)

〔摘要〕目的探討T輔助性17(Th17)細胞及CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T(Treg)細胞及相關因子在頸動脈粥樣硬化(AS)患者外周血中的表達水平及Th17細胞影響AS發(fā)病的機制。方法選取2012年7月至2014年7月來該院治療的AS患者(60例)為研究組，選取同期來該院體檢的健康人群為對照組(40例)，采用流式細胞術檢測AS患者及正常人外周血中Th17細胞及Treg細胞水平，采用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測兩組人群外周血中白介素(IL)-17以及轉化生長因子(TGF)-β的水平；采用RT-PCR法檢測兩組人群外周血中轉錄因子RORγT及Foxp3的mRNA水平。結果AS患者中Th17細胞比例，血清IL-17水平及外周血RORγT mRNA水平顯著高于AS對照組；Treg細胞比例、血清TGF-β水平及外周血Foxp3 mRNA水平顯著低于對照組(P<0.01)。結論Th17細胞及相關因子可能參與促進AS的產生，Treg細胞及相關因子可能參與抑制AS的產生，阻斷AS患者體內的IL-17可能作為治療AS的潛在手段。

〔關鍵詞〕Th17；調節(jié)性T細胞；IL-17；TGF-β；頸動脈粥樣硬化

1鄭州市中醫(yī)院消毒供應室2鄭州市中醫(yī)院檢驗科

第一作者：郭三強(1972-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事冠心病方面的研究。

目前，在動脈粥樣硬化(AS)的發(fā)病過程中的細胞學機制尚未完全清楚。CD4+T細胞是人體免疫系統(tǒng)中的一種重要免疫細胞，在抗原與抗原提呈細胞(APC)存在時可以分化為不同亞群，包括Th1、Th2、Th17及Treg細胞〔1~3〕。Th17與Treg功能上的失衡可能在AS的形成發(fā)展中起著重要的作用：Th17細胞是一群在TCR通路和細胞因子白介素(IL)-6及轉化生長因子(TGF)-β的刺激下分化的細胞亞群〔4〕，該細胞群參與AS的慢性炎癥病理過程〔5〕；Treg細胞則是一類調控機體免疫功能的細胞群，能維持免疫系統(tǒng)對自身成分的耐受，使機體保持免疫穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現，Apoe-/-小鼠體內Treg細胞能夠通過產生IL-10水平來減輕病理免疫反應，減慢AS的形成〔6〕。目前，對于Th17/Treg在AS形成的具體作用及機制尚不完全明了，本研究旨在探討Th17及Treg細胞與AS的聯系。

1資料與方法

1.1臨床資料選擇2012年7月至2014年7月入住我院的60 例AS患者為研究組，同時選取同期40例健康體檢者作為對照組。研究組通過頸動脈彩超證實有AS，其中男25例，女35例，年齡42~68歲(55.26±8.32)歲；對照組男14例，女26例，年齡44～67歲，平均(54.51±9.17)歲。兩組患者的性別、年齡等一般資料方面無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1Th17細胞及Treg細胞流式染色兩組患者均在早晨空腹采集外周血5 ml，加入EDTA抗凝劑和紅細胞裂解液裂解紅細胞后，以完全1640培養(yǎng)液調節(jié)濃度至1×106/ml。Th17細胞染色：離心并重懸于100 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)中，加入CD3-APC(eBioscience，0.2 mg/ml)和CD4-FITC(eBioscience，0.25 mg/ml)抗體，混勻后室溫避光孵育40 min，以PBS沖洗，加入破膜固定工作液1 ml后4℃避光孵育30 min，離心后，重懸于100 μl permeabilization buffer中，加入IL-17-PE(BioLegend，0.25 mg/ml)，4℃避光孵育30 min，以PBS緩沖液洗2遍后，以500 μl緩沖液重懸細胞后用流式細胞儀(FACS Calibur，美國BD公司)檢測。Treg細胞染色：離心并重懸于100 μl PBS中，加入CD25-APC(eBioscience，0.25 mg/ml)和CD4-FITC(eBioscience，0.25 mg/ml)抗體，混勻后室溫避光孵育40 min。以PBS洗1遍，加入破膜固定工作液1 ml后4℃避光孵育40 min，離心后，重懸于100 μl permeabilization buffer中，加入2 μl Fc受體阻斷劑(eBioscience)，4℃避光孵育20 min，加入抗FoxP3-PE(eBioscience，0.15 mg/ml)抗體，置4℃避光孵育40 min，以PBS緩沖液沖洗后，以500 μl緩沖液重懸細胞后用流式檢測。

1.2.2酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測血清中IL-17及TGF-β水平所有試劑盒均購自達科為科技有限公司，檢測流程嚴格按照試劑盒的說明書進行。

1.2.3采用RT-PCR法檢測外周血中轉錄因子RORγT及Foxp3的mRNA水平外周血離心后提取上層血漿150 μl，加入到1 ml Trizol充分勻漿，按照說明書的要求抽提總RNA，所得RNA溶于25 μl DEPC處理水中。提取的總RNA經紫外分光光度計進行定量分析，然后再采用Femantes逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩１緦嶒濸CR反應條件：95℃變性20 s，然后60℃ 20 s和70℃ 1 s進行40個循環(huán)。RORγT引物序列：正義：5′-GCAGCGCTCCAACATCTTCT-3′，反義：5′-ACGTACTGAATGGCCTCGGT-3′； Foxp3引物序列：正義：5′-CACCTGGCTGGGAAAATGG-3′，反義：5′-GGAGCCCTTGTCGGATGA-3′； 內參GAPDH引物序列：正義：5′-GCATGGGTCAGAAGGATTCCTc-3′，反義：5′-TCGTCCCAGTTGGTGACGAT-3′。使用ABI公司的7900型號Real-Time PCR儀器進行擴增，所得結果采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析〔7〕。

1.3統(tǒng)計學分析采用SPSS18.0軟件進行t檢驗。

2結果

2.1兩組外周血Th17及Treg水平比較對照組人群外周血中Th17細胞比例〔(0.57±0.41)%〕顯著低于研究組〔(1.87±0.31)%〕(t=18.03,P<0.01)；對照組人群外周血中Treg細胞比例〔(1.52±0.47)%〕顯著高于研究組〔(0.81±0.38)%〕(t=8.32,P<0.01)。

2.2兩組外周血中血清中IL-17及TGF-β水平研究組血清中IL-17水平〔(33.21±8.41)pg/ml〕顯著高于對照組〔(17.12±8.80)pg/ml〕(t=9.20，P<0.01)；研究組血清中TGF-β水平〔(17.21±8.73)pg/ml〕顯著低于對照組〔(27.21±9.27)pg/ml〕(t=5.47，P<0.01)。

2.3兩組外周血中轉錄因子RORγT及Foxp3的水平研究組外周血RORγT mRNA水平(3.23±0.25)顯著高于對照組(1.00±0.09)(t=63.222，P=0.000)；研究組外周血Foxp3 mRNA的表達水平(0.28±0.06)顯著低于對照組(1.06±0.13)(t=35.510,P=0.000)。

3討論

AS是一種主要累及主動脈、冠狀動脈、腦動脈、腎動脈和大、中型肌彈力型動脈，從而導致管腔狹窄以至完全堵塞，使這些重要器官缺血缺氧、功能障礙導致機體死亡。AS的主要臨床表現為血脂水平的升高，同時伴有炎癥和自身免疫系統(tǒng)病變的發(fā)生〔8〕。炎癥是介導AS發(fā)生、發(fā)展過程中重要的啟動因素，隨著炎癥的發(fā)展，AS患者體內活化的白細胞及內皮細胞等釋放出多種細胞因子，如纖維生長因子(FGF)、TGF-β以及表皮生長因子(EGF樣因子)等，從而刺激成纖維細胞和平滑肌細胞的增殖及遷移，最終形成內膜纖維肌性增殖性病變，使得AS逐漸加重〔9〕。

Th17及Treg 細胞是CD4+T淋巴細胞兩大類重要的亞群。其中，Th17是一群在IL-6、TGF-β等因子誘導下產生的T細胞亞群，該細胞能夠通過分泌IL-17參與自身免疫性疾病的機體防御〔10,11〕。Treg細胞是一群具有免疫抑制功能的T細胞亞群，可在存在IL-10和TGF-β等細胞因子的條件下誘導產生，該細胞能夠通過分泌TGF-β等因子參與機體多種自身免疫疾病的發(fā)生及發(fā)展，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、再生障礙性貧血、Ⅰ型糖尿病等〔11，12〕。

Th17及Treg細胞在AS中也日益受到人們的廣泛關注。Zhu等〔13〕認為，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的患者中，Th17及Treg細胞的失衡能夠顯著增加AS的發(fā)病率。Liu等〔14〕發(fā)現，在血管緊張素Ⅱ誘導的AS小鼠模型中，Th17能夠促進AS的發(fā)生。Rosario Espinoza Mora等〔15〕發(fā)現，在心源性休克患者體內Th17細胞數量顯著增加，被認為是該病的一個危險因素。在小鼠肝損傷模型中，在雷公藤誘導肝臟損傷的同時，Th17/Treg細胞亦發(fā)生失衡，偏向Th17分化〔16〕。本研究結果提示Th17/Treg 細胞的失衡參與了AS患者的免疫應答，這與以往研究認為的Th17可能具有潛在的促進AS的功能相一致〔6,17〕。此外，AS患者中Th17/Treg細胞的失衡可能通過影響分泌的因子來參與調節(jié)AS的進程。

Subramanian等〔18〕認為，Treg細胞介導的抑制AS過程主要依賴于Myd88信號途徑。而Wasserman等〔19〕發(fā)現，IL-33可以通過增加Treg細胞水平來抑制AS的發(fā)展。本研究提示了IL-17可能參與并促進AS發(fā)病的過程。

4參考文獻

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〔2015-10-08修回〕

(編輯滕欣航)

通訊作者：李敏(1978-)，女，主管護師，主要從事職業(yè)防護方面的研究。

基金項目：鄭州市2014年市級指導性科技計劃項目(No.20140526)

〔中圖分類號〕R743.3

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)03-0590-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.033