以長白豬為受體母豬的手術法胚胎移植的體會

賈秀偉，吳　晶，孫之皓，張　舟，尹熙俊，李文學

（1.延邊大學農(nóng)學院動物醫(yī)學系，吉林 延吉 133002；2.延邊大學農(nóng)學院動物科學系，吉林 延吉 133002）

以長白豬為受體母豬的手術法胚胎移植的體會

賈秀偉1，吳晶1，孫之皓1，張舟1，尹熙俊2，李文學1

（1.延邊大學農(nóng)學院動物醫(yī)學系，吉林 延吉 133002；2.延邊大學農(nóng)學院動物科學系，吉林 延吉 133002）

胚胎移植技術是克隆豬、轉(zhuǎn)基因豬等研究進行的基礎。隨著豬的繁殖生物技術的需要，豬胚胎移植技術也得到了快速發(fā)展。豬胚胎移植于1951年獲得成功［1］，但因豬生理特點及其受精卵抵抗低溫較弱等特點，直到1975年Cumock才將其應用于實際，胚胎移植技術作為一種豬群凈化手段為世界所關注［2］。1989年我國成功得到豬胚胎移植后代，之后相繼得到試管豬、克隆豬和轉(zhuǎn)基因豬。胚胎移植技術是豬生產(chǎn)中不可或缺的技術環(huán)節(jié)，是豬繁殖和改良的重要手段。

1　材料與方法

1.1試驗動物由吉林省龍井市農(nóng)業(yè)科技研究所豬場提供的自然發(fā)情的經(jīng)產(chǎn)長白豬母豬24頭，健康狀態(tài)良好，體重均在200 kg左右，術前禁食24 h、禁水6 h。

1.2胚胎（2～4cells）卵母細胞從延吉市屠宰場的豬卵巢中吸取獲得、培養(yǎng)，體細胞是五指山豬耳細胞，胚胎由吉林省轉(zhuǎn)基因動物與胚胎工程重點實驗室構建。

1.3試驗器材及藥品常規(guī)外科手術器械；復方氯胺酮，購自沈陽市獸藥廠，生產(chǎn)批號：20100605。

1.4麻醉與消毒母豬保定確實后，按2 mL/100 kg體重耳靜脈注射復方氯胺酮；麻醉后，術部進行剪毛、剃毛、清洗、消毒。

1.5術式在倒數(shù)第一對乳頭與第二對乳頭之間的腹中線上做一長約15 cm左右的切口；常規(guī)切開腹壁，暴露腹腔；探查腹腔，將子宮角、輸卵管及卵巢緩慢拉出腹腔外，觀察輸卵管傘、輸卵管及卵巢的狀態(tài)，用生理鹽水浸濕的滅菌紗布覆蓋其表面。術者撐開輸卵管傘，并捋直輸卵管壺腹部；同時，移卵助手將已吸入胚胎（約150枚左右）的導管，通過輸卵管傘腹腔口將胚胎注入輸卵管峽部；將子宮、輸卵管及卵巢還納腹腔，常規(guī)關閉腹腔。在切口處涂抹抗菌軟膏，然后噴涂傷口修復液。

1.6術后護理術后將受體母豬移至架空式產(chǎn)床，不應用抗生素，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.7妊娠診斷22 d后使用B超結合豬早孕檢測試劑盒進行妊娠診斷。

2　結果

2.1受體母豬在術后1～2 d，出現(xiàn)食欲減退，個別受體母豬（3/24）體溫有所升高；術后3 d，受體母豬食欲恢復正常，體溫正常。

2.2經(jīng)檢測24頭受體母豬，11頭妊娠；妊娠母豬共分娩67頭克隆仔豬，母豬平均產(chǎn)仔率約為6只/頭，其中新生仔豬因各種原因死亡22頭。

3　討論

3.1移植的條件（1）受體母豬：受體母豬的選擇有大型豬和小型豬之分，Hoshino［3］等研究表明，大型豬似乎更適合作為小型豬克隆胚胎的移植受體。本試驗選用長白豬這種大型母豬作為受體母豬。有研究稱經(jīng)產(chǎn)母豬作為受體母豬產(chǎn)仔數(shù)及克隆效率均高于青年母豬，可能因為其激素水平相對穩(wěn)定，胚胎易于著床，且有較大的子宮容量，當胚胎存活的數(shù)量充足時，胎盤的大小和子宮的容量就會影響到最終的產(chǎn)仔數(shù)量［4］。本試驗選用經(jīng)產(chǎn)母豬作為受體母豬。羅學明等［5］研究表明，處于即將排卵或正在排卵階段的受體母豬比排卵前階段或完全排卵階段的受體母豬妊娠率高很多。本試驗選用處于即將排卵或正在排卵階段的母豬作為受體母豬，卵巢狀態(tài)良好，有5 mm以上的大卵泡，輸卵管傘充血，輸卵管壺腹部充血擴張，且直徑約為峽部的2～3倍左右；（2）移植方法：豬的胚胎移植法有3種：分別為手術法、非手術法以及內(nèi)窺鏡法。其中以手術法為主，因為豬生殖道形態(tài)特殊，子宮頸深，皺褶又多，將輸卵管由子宮頸送入到子宮有一定難度且子宮角長，彎曲多，容積大，非手術法進行移植難度相當大，而內(nèi)窺鏡移植法進行實驗時視野狹窄，操作難度很大。輸入胚胎方法目前主要有兩種，由輸卵管腹腔口移植和輸卵管打孔移植，研究表明，克隆胚胎經(jīng)由輸卵管腹腔口移植比輸卵管打孔移植具有更高的移植分娩率和克隆豬效率［6］，輸卵管打孔移植雖然操作簡單，但可能由于打孔時的刺激或者造成出血等原因，導致豬胚胎移植效果并不理想。故本試驗采用輸卵管腹腔口移植胚胎，受體母豬妊娠率為45.83%（11/24），11頭受胎母豬共分娩67頭克隆豬；（3）胚胎的發(fā)育階段及移植部位：移植的豬體細胞克隆胚胎發(fā)育階段與受體母豬子宮或輸卵管發(fā)育階段的相匹配性是提高胚胎移植效率的至關重要的影響因素，如果不匹配就可能導致胚胎著床失敗［5］。據(jù)研究表明，將胚胎移入子宮角中部和尖端時的妊娠率遠遠高于胚胎植入子宮體的妊娠率，而且進行一側輸卵管的移植，胚胎也可到達另一側子宮角。因為本試驗是將2～4細胞胚胎移入，綜合母豬的生理狀態(tài)將胚胎移入輸卵管峽部。豬體細胞克隆胚胎移植后的受胎率從29%～100%不等，一般在30%～50%［7］。本試驗妊娠率45.83%（11/24）。針對豬胚胎移植的階段不同研究者有著不同的研究結論，Vajta等［7］人認為一般在1～4期細胞階段進行手術法移植。也有人認為4～8細胞期最好，8～16細胞期次之，而桑椹胚至囊胚效果不理想［8］；本試驗選用2～4細胞期的胚胎進行移植；（4）胚胎的數(shù)量：一般認為克隆胚胎的質(zhì)量不如體內(nèi)胚胎，故胚胎移植時常常將大量的豬克隆胚胎移入子宮或輸卵管內(nèi)。克隆胚胎的個數(shù)往往在幾十枚和上百枚之間［8］。本試驗進行移植時移入150枚左右的胚胎。

3.2麻醉藥的選擇據(jù)Fanchin［9］等的研究表明，在人的胚胎移植中，子宮的刺激收縮對胚胎移植后的妊娠率有很大影響。所以麻醉不僅能減少疼痛對受體機體及子宮的影響，而且有助于提高胚胎移植成功率。在實驗豬的麻醉方法及麻醉劑的選擇與用量方面國內(nèi)外都做了很多研究，但大部分研究是針對小型豬。本試驗采取的是耳靜脈注射復方氯胺酮，約10 s即可進入麻醉狀態(tài)且可維持麻醉效果約40 min，此麻醉方法進入麻醉狀態(tài)快，無嘔吐，無明顯流涎，無需麻醉前給藥，方便可行，尤其是針對40 min內(nèi)可以完成的手術如胚胎移植手術，非常適用。

3.3是否應用抗生素研究表明，抗生素對發(fā)育中的胎兒可能存在致畸或毒性作用［10］。為了避免使用抗生素可能對胚胎在受體母豬妊娠造成的不利影響，本試驗術后未使用任何抗生素。經(jīng)觀察，雖未使用抗生素但是創(chuàng)口并無感染、化膿等炎性癥狀，對豬創(chuàng)口的愈合無不良影響。這得益于術前的充分清洗、嚴格消毒及無菌操作，縫合后使用傷口修復液覆蓋傷口，可使切口快速愈合，且避免細菌感染。

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S828

B

0529-6005（2016）09-0053-02

2015-07-10

國家轉(zhuǎn)基因重大專項基金支持項目（2009ZX0800-6-002B）

賈秀偉（1990-），女，碩士，主要從事小動物臨床研究，E-mail：jiaqiqi640@163.com

李文學，E-mail：liwx@yub.edu.cn