非水酶催化及其在香精香料合成中的應用

張志國，田鑫，陳媛，孫迪

(齊魯工業大學 食品科學與工程學院，濟南 250353)

非水酶催化及其在香精香料合成中的應用

張志國*，田鑫，陳媛，孫迪

(齊魯工業大學 食品科學與工程學院，濟南 250353)

概述了非水酶催化的歷史、非水酶催化的優點，闡述了有機溶劑、離子液、SCF等非水酶催化的介質，最后就利用非水介質酶催化短鏈芳香酯、芳香內酯、香蘭素等香料的合成進行了綜述。

非水酶；催化；香料

在非水介質中進行酶催化反應的研究稱非水酶學(Non-aqueous Enzymology)。非水酶學是近年來酶學研究領域的一個重要分支，非水介質酶催化是目前生物技術、有機合成等領域的前沿性課題之一。傳統觀點認為酶只能在水溶液環境中進行催化，但近年來的研究證明，酶在非水介質中仍可表現出催化活性，并且表現出在水介質中所不具有的特有的催化特性。非水介質酶催化的用途很多，近年來其在香精香料的制備中有了一定發展。

1 非水介質酶催化的歷史

早在1936年，美國華沙大學的Sym就在BiochemistryJournal上報道了酯酶在有機溶劑中的催化作用[1]，但當時由于對此存在爭議，未能引起有關學者進行進一步研究的興趣。1977年，前蘇聯的Klibanov在“水-非水溶性有機溶劑”兩相體系中，用胰蛋白酶合成了L-色氨酸乙酯，結果表明在水反應體系中，酯的產率僅有0.01%，在“水-非水溶性有機溶劑”兩相體系中，酯的產率接近100%，證實了在接近無水的條件下，有利于酯化反應的進行[2]。1984年，他又與Zaks合作，在Science上發表了一篇關于酶在有機介質中的催化作用的論文。他們在僅含微量水的有機介質(Microaqueous Media)中成功地酶促合成了酯、肽、手性醇等許多有機化合物，并證實了酶在100 ℃高溫下，不僅能夠在有機溶劑中保持穩定，而且還顯示出很高的催化轉酯活力[3]。他們的發現在世界范圍內引起了對非水介質酶催化的興趣，這一發現為酶學研究和應用帶來了一次革命性飛躍，打破了傳統的生物催化概念，將酶引入非水介質中，并成為酶學和有機合成研究中一個迅速發展的新領域，開辟了酶學研究領域的另一個重要分支——非水酶學，開啟了非水酶學研究的先河。

1987年，中國科學院上海生化所黃中祥[4]在我國首先進行了有機溶劑中酶催化反應的報道。之后，吉林大學酶工程實驗室的羅貴民[5]、湖北大學的曾和平[6]陸續進行了非水介質中酶催化反應的報道，但這些都僅限于綜述性的報道。直到1991年，曹淑桂等[7]報道了豬胰脂肪酶在凍干時的pH值、有機溶劑的極性、反應系統的含水量、溫度以及底物碳鏈的長度和支鏈對酶在有機相中催化活性的影響規律，并利用該酶合成了具有玫瑰香味的月桂酸香茅酯和辛酸香茅酯。此后，在我國真正意義的非水酶催化研究才陸續展開。

2 非水介質酶催化的優點

非水相中的酶催化之所以引起人們如此大的興趣，是因為酶在有機溶劑中表現出了全新的性質。例如酶在非水相中可以催化許多在水相中不可能進行的反應，而它本身卻十分地穩定。與在水相中進行的酶促反應相比，非水相酶催化具有以下優點：有利于疏水性底物的反應；可提高酶的熱穩定性；能催化在水中不能進行的反應；可改變反應平衡移動方向；可控制底物專一性；可防止由水引起的副反應；可擴大反應pH值的適應性；酶和產物易于回收；可避免微生物污染[8，9]。

3 非水介質的類型

近年來，對酶在非水介質中的催化作用的研究日趨增多，從最早的以有機溶劑作為非水介質，發展到離子液[10]、超臨界流體[11]等作為酶反應的介質，值得注意的是非水介質并非絕對無水，由于酶需要有一定量的水來維持其催化活性。在非水酶學研究中，存在一種共識，在非水或低水環境中，只要酶分子的“必需水”層不被剝除，酶就可以有效地發揮其催化作用，這種與水溶液環境相差很大的酶催化反應環境稱為“非水相”或“非水介質”。

3.1 有機溶劑

在非水介質酶學研究中，以有機溶劑作為反應介質是研究最早、也是研究最多的一種非水介質，所以，常將以有機溶劑作為反應介質的酶催化稱為有機介質中的酶催化。Zaks提出了非水相酶學的一個具有普遍意義的定律：作為反應介質，非極性溶劑優于極性溶劑。由于極性溶劑，特別是與水互溶的有機溶劑會爭奪，甚至剝除蛋白質分子的“必需水”層，擾亂酶分子天然構象的形成。這一說法確實可以作為 Zaks定律的一個合理解釋。Zaks和 Klibanov檢測了在各種溶劑中水對醇脫氫酶、醇氧化酶及多酚氧化酶活性的影響，結果表明：有機溶劑是通過與酶分子周圍的水層而不是酶分子本身發生作用的。他們還發現，隨著增加溶劑中的水含量，酶的活力迅速增加。表達有機溶劑對酶催化活力影響的一個比較準確，或者說是較為有意義的術語是溶劑“扭曲(或擾動)”酶的水結合區的能力，即有機溶劑穿透并進入催化劑的“必需水”層，或將“必需水”推開或拉脫的能力。溶劑的這種水擾動能力與其性質密切相關。Laane等深入研究了107 種溶劑的理化性質與酶功能的相關性，其中包括 Hildebrand(希爾德布蘭德)溶解度參數(δ)、介電常數(ε)、偶極矩(μ)以及疏水常數(log P，辛醇-水雙相體系中的分配系數)，發現log P與酶活力之間具有最好的相關性，用log P表征溶劑極性時，酶活性與溶劑極性之間具有更好的相關性，發現酶催化活性與溶劑疏水常數之間的關系是一條S 形曲線，在log P<2的極性溶劑中的催化活性較低，在2 4的非極性溶劑中催化活性較高[12]。

3.2 離子液

離子液體一般是指由體積相對較大的有機陽離子和體積相對較小的無機或有機陰離子構成、在室溫或近于室溫下呈液態的物質，是一種低熔點的鹽(<100 ℃)。與常規的有機溶劑不同的是，離子液沒有蒸汽壓，能夠溶解多種物質，可溶解一般有機溶劑不能溶解的底物，并且可以和多種溶劑形成兩相體系，具有低毒、穩定、不揮發等特點,被稱為綠色反應介質。離子液體可提高酶的穩定性，維持酶的催化活性[13]。由于離子液所具有的獨特性質，使其成為一種生物催化反應的理想溶劑。但是，目前離子液的價格還很高，價格因素將限制其在大規模生產中的應用。

3.3 超臨界流體

超臨界流體指溫度和壓力均在本身的臨界點以上的高密度流體，具有和液體同樣的凝聚力、溶解力；然而其擴散系數又接近于氣體，是通常液體的近百倍。超臨界CO2是應用最廣泛的超臨界流體，它不但具有超臨界流體的一般特性，而且還具有無毒、無害、不燃燒、無污染、容易回收和可循環利用等特點，是環境友好的綠色溶劑。但是超臨界CO2作為非水酶催化的反應介質僅限制在以低極性的底物的作為反應底物催化反應中[14]。

4 非水酶催化在合成香料中的應用

4.1 短鏈芳香酯的合成

短鏈芳香酯類香料是日化香精和食用香精的調香配方中十分重要的香料品種,應用十分廣泛。傳統短鏈芳香酯類香料的合成方法主要是醇和有機羧酸之間的直接酯化法。使用最多的是以成本低廉的濃硫酸作催化劑，由于該工藝存在設備腐蝕、環境污染、生產周期長、副反應較多、后處理操作比較復雜、費時費料等一系列不足,與食用安全、綠色化學和清潔生產要求格格不入,因此急需開展新工藝技術的研究開發和應用。在非水介質中使用脂肪酶催化酯化反應生產食用香料是一個很好的選擇。Maha等利用脂肪酶催化合成了戊酸乙酯(青蘋果味)和乙酸己酯(桃子味)[15]。Gubicza等利用Novozyme 435脂肪酶催化合成了乙酸乙酯、乙酸異戊酯、丙酸異戊酯、丁酸乙酯、丁酸異戊酯等短鏈芳香酯[16]。Rajnish等以超臨界CO2作為反應介質進行了脂肪酶催化不同脂肪酸與異戊醇發生酯化反應形成不同種香料的研究[17]。Rachna等利用固定化玫瑰酵母以異辛烷作為反應介質合成了己酸乙酯[18]。

4.2 芳香內酯的合成

芳香內酯是羥基脂肪酸分子經過分子內酯化形成的化合物，具有濃郁的香氣，在各種具有水果味、可可味、奶酪味及堅果味的食品中都曾分離得到γ-內酯和δ-內酯，而某些大環ω-內酯具有珍貴的麝香香味，它們在食品和化妝品工業中有重要應用價值。Ahmed等利用來自洋蔥假單胞菌(Pseudomonascepacia)的脂肪酶催化合成了γ-內酯和δ-內酯[19]。沈芳等利用固定化Candidasp.GXU08 菌株產脂肪酶催化15-羥基十五烷酸甲酯合成環十五內酯(δ-內酯)[20]。

4.3 香蘭素的合成

香蘭素是在食品、香水、制藥等行業被普遍應用的香料之一。1816年，香蘭素第一次被從香莢蘭豆莢中分離得到，其結構在1874年被確定。如今，全世界的香蘭素消耗量每年大約在12000噸，大約有50噸的天然香蘭素來自香蘭豆莢，其余的來自化學合成。由于香蘭豆莢的來源有限，受產地、天然等因素的影響，成本高致，使天然香蘭素的價格昂貴。盡管如此，利用植物提取法生產的天然香蘭素無法滿足市場的需求，再加上美國和歐盟等標準中規定，化學合成的風味物質不能用作天然風味，使研究者越來越感興趣于利用其他的天然資源，如利用生物技術來生產天然香蘭素。近年來對微生物轉化法生產香蘭素的研究較多，但一般情況下香蘭素只是中間代謝產物，會繼續降解而不易積累。因此，除了繼續設法尋找可在代謝途徑中積累香蘭素的菌株外，用酶轉化法生產香草醛是近年來又一個很有前景的研究方向[21]。Mane等利用大豆脂氧合酶將異丁香酚轉化為香蘭素[22]，并申請了美國專利。李永紅等也在利用大豆脂氧合酶法轉化異丁香酚制備香蘭素方面獲得了成功[23]。

4.4 其他應用

酶作為高效的生物催化劑，還可以進行光學活性物質的拆分或合成。薄荷醇，其俗名為薄荷腦，又名六氫百里香酚，是一類非常重要的香料，被廣泛用于食品、醫藥、日化等行業，是一個典型的被酶有效拆分的香料。薄荷醇分子中存在3個手性中心，理論上有8個立體異構體，各具有不同的物理性質，在8個立體異構體中，只有D-薄荷醇和L-薄荷醇具有應用價值，L-薄荷醇具有特有的薄荷香氣并有強烈的清涼作用，而D-薄荷醇卻無清涼作用，而且還具有辛辣刺激性氣味，微帶樟腦氣味。正是由于這些差異，使得L-薄荷醇比D-薄荷醇有更高的應用價值，所以要對其進行手性拆分。Elisabetta等用脂肪酶對薄荷醇的消旋混合物成功地進行了拆分[24]。

奶味香精是食品工業中應用最為廣泛的香精之一，主要用于冷食、糖果、飲料等的增香。武彥文等利用脂肪酶對不同類型的奶油、奶酪和牛奶等進行酶解，以乙醇或丙酮為溶劑在非水介質下得到了奶香濃郁、賦香效果明顯的奶味香精[25]。

5 結束語

非水相酶催化是目前生物技術中的前沿性課題之一，其在香精香料中的應用研究正在日益開展，盡管某些產品還僅限于在實驗室中進行，但隨著非水酶學的研究深入，目前非水酶催化反應研究已取得了較大發展，相信今后會有更多的香精香料產品實現非水酶催化的規模化今后工業生產。

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Non-aqueous Enzymatic Catalysis and Its Application in Synthesis of Flavors and Fragrances

ZHANG Zhi-guo*, TIAN Xin, CHEN Yuan, SUN Di

(College of Food Science and Engineering, Qilu University of Technology, Ji'nan 250353, China)

Summarize the history and advantages of non-aqueous enzymatic catalysis; expound the non-aqueous medium of enzymatic catalysis such as organic solvent, ionic liquid, SCF and so on. Finally, review the synthesis of short chains of aromatic esters, aromatic lactone, vanillin and other spices catalyzed with non-aqueous medium enzymes.

non-aqueous enzyme; catalysis; spices

2016-06-15 *通訊作者

張志國(1974-)，男，副教授，博士，主要從事食品資源開發方面的研究； 田鑫(1992-)，男，碩士，主要從事食品資源開發方面的研究。

TS202.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2016.12.031

1000-9973(2016)12-0134-04