食品及調味品中罌粟成分的實時熒光PCR檢測方法

高琴，宗凱，楊捷琳*， 潘良文

(1.上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術中心，上海 200135；2.安徽出入境檢驗檢疫局技術中心，合肥 230022)

食品及調味品中罌粟成分的實時熒光PCR檢測方法

高琴1，宗凱2，楊捷琳1*， 潘良文1

(1.上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術中心，上海 200135；2.安徽出入境檢驗檢疫局技術中心，合肥 230022)

針對食品及調味品非法添加罌粟成分的檢測需求，針對罌粟小檗堿橋酶基因設計了TaqMan特異性引物和探針，并建立了食品及調味品樣品前處理和DNA提取方法，建立了食品及調味品中罌粟成分TaqMan實時熒光PCR檢測方法，方法檢出限為0.01%，靈敏度為10 pg。與普通 PCR法和SYBR Green等熒光染料法相比，TaqMan探針法具有更好的特異性，檢出限更低，結果判讀直觀無污染。方法的建立可作為食品及調味品中非法添加罌粟成分的檢測鑒定方法，也可為其他與罌粟相關的方法研究提供借鑒和參考。

罌粟；食品；調味品；TaqMan 實時熒光PCR

近年來，多地傳出火鍋底料中加入罌粟殼的報道，國家衛計委及工商部雖已加強管理，但屢禁不止。仍有商家為了牟取利益，不惜違法亂紀，在調料中加入罌粟成分或是未經滅活的罌粟種子，給消費者的身體健康帶來極大危害。罌粟殼為罌粟科植物罌粟的干燥成熟果殼，具有斂肺止咳、澀腸、止痛的功效，包含嗎啡、可待因、罌粟堿等20多種生物堿。吸食罌粟殼及其制品，會使吸食者在心理、生理上成癮，對人體的肝臟、心臟等器官產生毒害作用。因此，罌粟殼在我國被列入麻醉藥品的范圍予以管制，作為非食用物質，嚴格禁止在食品及調味品中添加使用。

目前罌粟成分的檢測方法主要集中在對于罌粟來源生物堿成分的檢測[1]，方法主要有薄層層析法、紫外分光光度法[2]、液相色譜法[3-5]、氣相色譜-質譜法、酶聯免疫法[6]。這些方法適用范圍較廣，但僅能對食物中罌粟殼殘留的生物堿進行間接檢測，不能對罌粟物種來源進行準確定性，不能充分滿足對罌粟違禁成分的執法檢驗和整治監管的需要。

本試驗建立了利用實時熒光定量PCR (real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)技術檢測食品及調味品中罌粟成分的檢測方法[7]，針對罌粟特有基因小檗堿橋酶基因(Papaversomniferumberberine bridge enzyme bbe1)設計特異性的引物和探針，提取調味品總DNA后，進行PCR擴增檢測，其檢出限和靈敏度分別達到0.01%和10 pg。同時，針對火鍋底料高油脂含量的特點建立優化了DNA提取方法。本實驗建立的TaqMan探針熒光定量PCR檢測方法，相比于以往的普通PCR法和熒光染料法具有無污染，特異性更強，靈敏度更高，檢出限更低的特點[8]。因此，該方法特別適用于各類調味品中非法添加罌粟成分的檢測，為食品及調味品中罌粟成分快速、準確檢測標準的制定提供依據，為相關產品的執法監管提供技術保障。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

桂皮、八角、香葉等7種調味品，海底撈清湯火鍋底料、燉肉料、排骨鮮味王等8種復合調味品均購自上海世紀聯華超市。魚腥草、金銀花、紫花地丁等36種藥材均由安徽出入境檢驗檢疫局技術中心提供，見表1。罌粟種子為實驗室保存樣品。

表1 用于罌粟特異性檢測的樣品列表

續 表

TianGen DP-305植物基因組DNA提取試劑盒、TianGen DP-326深加工食品DNA提取試劑盒購自天根生物有限公司(TianGen Biotech (Beijing)Co., Ltd., Beijing, China)；引物和探針由輝瑞公司合成(Pfizer, Inc. NYSE：PFE,USA)；TaqMan Gene Expression Master Mix(貨號：4369016)試劑均購自Applied Biosystems 公司(Applied Biosystems Inc., USA)。

試驗相關儀器：有液氮冷凍研磨儀SPEX 6580 SPEX，USA；紫外分光光度計Nanovue Plus GE Healthcare，United Kingdom；實時熒光PCR儀ABI Viia7，實時熒光PCR儀ABI 7300 Applied Biosystems Inc.,USA；BP310S電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；5415R冷凍離心機 上海奧陸生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

1.2.1.1 固體樣品

稱取25 g樣品，用液氮冷凍研磨儀研磨粉碎，稱取200 mg樣品至離心管中，按照1.2.2步驟提取DNA。

1.2.1.2 液體樣品(火鍋底料等油脂含量較多的樣品)

稱取250 g樣品，倒入500 mL的分液濾斗中(可以準備2個分液濾斗)，靜置1～2 h，樣品會分為3層，上層是油脂，中間是水相，下層是固體殘渣。

殘渣處理：將殘渣分離到100 mL燒杯中，取部分殘渣到研缽或者研磨儀中，研磨粉碎，取1～2 mL至離心管中。

水相處理：殘渣分離后向分液濾斗中加入100 mL石油醚，震蕩5 min后靜置，收集下層水相，采用大體積濃縮儀(40～60 ℃+抽真空+低速離心)濃縮至1～5 mL，取1 mL至離心管(2 mL)中。

殘渣和濃縮后水相均采用1.2.2步驟繼續提取罌粟DNA。

1.2.2 罌粟及香辛料、藥材的DNA提取

采用TianGenDP-305植物基因組DNA提取試劑盒(TianGen DP305-02)提取桂皮、八角、香葉等7種香辛料和魚腥草、金銀花、紫花地丁等36種藥材的DNA。采用TianGen DP-326植物基因組DNA提取試劑盒提取海底撈清湯火鍋底料、燉肉料、排骨鮮味王等8種復合調味品中的DNA。提取的DNA采用紫外分光光度儀Nanovue Plus測定濃度和純度，模板量控制在30 ng/反應以上。

1.2.3 引物設計和熒光PCR擴增

針對罌粟小檗堿橋酶bbe1基因設計特異性引物探針，引物及探針序列見表2[9，10]。實時熒光PCR反應體系見表3。

表2 引物及探針序列

表3 SYBR Green 實時熒光PCR反應體系

TaqMan實時熒光PCR反應程序為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，90 ℃ 10 s ，58 ℃ 1 min，58 ℃收集熒光，共45個循環。

1.2.4 方法特異性

選取常見的香辛調味料 7種，罌粟近緣植物虞美人，其他植物種類包括魚腥草、金銀花、紫花地丁等共36種，按照1.2.1的方法進行前處理后，實時熒光PCR擴增檢測引物特異性。

1.2.5 方法靈敏度

將抽提得到的罌粟種子基因組DNA測定濃度，調整濃度為100 ng/μL，10倍梯度稀釋成10 ng/μL，1 ng/μL，100 pg/L，10 pg/L，1 pg/L共6個濃度梯度，進行靈敏度試驗。

1.2.6 方法檢出限

將罌粟種子樣品研磨粉碎后，按照重量比分別添加到不含罌粟成分的玉米淀粉基質中，制備成100%，10%，5%，2%，1%，0.1%，0.01%，0.001%共8個梯度含量的樣品，進行檢出限試驗。

2 結果與討論

2.1 引物特異性試驗

將7種香辛調味料和36種常用藥材與罌粟種子一起抽提DNA并純化，抽提情況見表4，以罌粟種子DNA為陽性對照，以超純水為陰性對照，利用表2選取的擴增體系對引物進行特異性試驗。擴增結果見圖1。可見引物和探針僅對罌粟種子DNA擴增陽性，有明顯S型擴增曲線，對其余7種香辛調味料和36種常用藥材擴增陰性，提示該引物和探針特異性好。

表4 7種香辛料和36種藥材中DNA抽提情況

圖1 實時熒光 PCR引物特異性試驗擴增曲線圖

2.2 實時熒光PCR靈敏度試驗

取10 ng/μL，1 ng/μL，100 pg/L，10 pg/L，1 pg/L 5個梯度稀釋的模板各1 μL進行PCR擴增，擴增Ct值見表5，擴增曲線見圖2。可知隨罌粟成分濃度的降低，擴增Ct值呈梯度增大，在模板使用量為10 pg時，有明顯S型擴增曲線，檢出靈敏度達到10 pg。

表5 實時熒光PCR靈敏度試驗Ct值

圖2 實時熒光PCR靈敏度試驗擴增曲線圖

2.3 實時熒光PCR檢出限試驗

抽提獲得罌粟含量分別為100%，10%，5%，2%，1%，0.1%，0.01%，0.001%共8個梯度的系列稀釋品，取每孔10 ng用于PCR擴增，擴增Ct值見表6，擴增曲線見圖3。

表6 實時熒光PCR檢出限試驗Ct值

圖3 實時熒光PCR檢出限試驗擴增曲線圖

注：A:0.001%，B:100%，C:10%，D:5%，E:2%，F:1%，G:0.1%，H:0.01%。

由圖3可知，隨著罌粟成分濃度的降低，擴增Ct值呈梯度增大，0.01%的模板有明顯的S型擴增曲線，檢出限達到0.01%。

2.4 實時熒光PCR方法在市場樣品檢測中的應用

在上海世紀聯華超市購買的8種調味品樣品，提取DNA后測定濃度并擴增18S rRNA，見表7。其中1種未提取到可供檢測的DNA。隨后以罌粟種子DNA為陽性對照，各取100 ng進行擴增試驗，擴增曲線見圖4。結果表明該批超市抽取樣品中未檢出陽性。

表7 8種調味料DNA抽提情況

圖4 8種調味料實時熒光PCR擴增曲線圖

3 結論

本試驗建立了罌粟成分的實時熒光PCR 檢測方法，針對罌粟物種特異基因設計引物和探針，僅需結合實時熒光擴增曲線圖，2 h就能準確檢測到調味料中罌粟這一非法添加物的存在，靈敏度達到10 pg，檢出限達到0.01%。目前市面上用的香辛料原料或復配獲得的復合調味品品種繁多，其中含有大量的芳香類、色素類、油脂類物質，成分復雜，本試驗在樣品前處理上針對固體樣品(主要是粉狀、塊狀)和液體樣品(主要是油狀、膏狀、糊狀、汁狀)采取不同的前處理方法，以降低上述各類物質對DNA提取的干擾，提高檢測的靈敏度。本試驗在引物和探針的特異性試驗中，除了選取常用的7種香辛料，還選取了與罌粟具有同源性的36種藥材，表現了引物和探針的良好特異性。實時熒光PCR檢測方法直接針對罌粟物種特異DNA，具有較高的檢測靈敏度和準確度，操作簡便，可作為復合調味品中非法添加罌粟成分鑒定的快速檢測方法。同時，該方法在食品添加劑和調味品安全領域的檢測把關上，具有較好的應用前景。

[1]閆瑾，趙美萍，李元宗,等.罌粟堿檢測方法研究進展[J].化學進展，2005，17(5):897-904.

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Detection of Papaver somniferum in Food and Condiment by Real-time PCR

GAO Qin1, ZONG Kai2,YANG Jie-lin1*, PAN Liang-wen1

(1.Technical Center for Animal, Plant and Food Inspection and Quarantine, Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shanghai 200135,China；2.Technical Center of Anhui Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Hefei 230022,China)

A method of real-time PCR is established for detectingPapaversomniferumingredient in food and condiment. The TaqMan specific primers and probes are designed forPapaversomniferumberberine bridge enzyme bbe1. The pre-processing and DNA extraction method is set up for detecting food and condiment samples. The limit of detection (LOD) ofPapaversomniferumingredient in food and condiment for this method is 0.01%. The absolute sensitivity ofPapaversomniferumgenomic DNA detection is 10 pg. Compared with the conventional PCR and SYBR Greenfluorescent dye PCR such as SYBR Green, TaqMan probe method has better sensitivity and specificity, visible results and without pollution. This method could be applied for detectingPapaversomniferumin food and condiment. Meanwhile, it can provide references for otherPapaversomniferumdetection methods.

Papaversomniferum;food;condiment; TaqMan real-time PCR

2016-06-11 *通訊作者

高琴(1983-)，女，上海人，工程師，研究方向：食品及農產品檢測。

TS207.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2016.12.026

1000-9973(2016)12-0113-05