結核分枝桿菌臨床分離株的基因分型及相關耐藥性分析

趙淑杰 韓利軍 趙振國

結核分枝桿菌臨床分離株的基因分型及相關耐藥性分析

趙淑杰 韓利軍 趙振國

目的 分析結核分枝桿菌臨床分離株的基因分型及相關耐藥性。方法 收集本市的120株結核分枝桿菌分離株，使用Spoligotyping法和PCR法進行基因分型，并予以藥敏檢測。結果 120株結核分枝桿菌以北京家族為主，在北京家族中以現代型為主。北京家族菌株現代型和古代型的耐藥性相比差異無統計學意義（P＞0.05）。結論 本地區的結核分枝桿菌具有基因多態性，主要基因型為北京家族，北京家族菌株與非北京家族菌株的耐藥性差異無統計學意義。

結核；分枝桿菌；基因分型；耐藥性

隨著抗生素的廣泛應用，結核分枝桿菌的耐藥性不斷增加，對人類健康造成了嚴重的威脅［1-2］。本次分析本院收集的120株結核分枝桿菌臨床分離株，對其進行基因分型研究和耐藥性分析，結果如下。

1　材料與方法

1.1標本來源及資料

120株結核分枝桿菌臨床分離株均來自本院的120例結核病患者，其中男75例，女45例，年齡18～78歲，平均年齡（50.3±2.5）歲。H37Rv標準株由中國疾病預防控制中心傳染病所提供。

1.2試劑

2×PCR混合體系（無錫博慧斯生物醫藥科技有限公司），DNA分子標記、L-J藥敏培養基（珠海貝索生物技術有限公司），Biodyne C膜（美國Biosupport公司）、鏈霉親和素過氧化物酶和CDP-star（美國CE公司）。

1.3方法

1.3.1Spoligotyping分 型 （1）CNA提取：用 生 理 鹽水將結核分枝桿菌從培養基洗脫，予以80℃孵育30 min滅活，沸水煮30 min，離心半徑設置10 cm，12 000 r/min離心3 min，取上清為DNA模板，零下20℃保存備用。（2）PCP擴增：引物DRa和DRb擴增結核分枝桿菌DR區。DRa：5'-GGTTTTGGGTCTGACGAC3'，5'端進行生物素標記；DRb：5'-CCGAGAGGGGACGGAAAC-3'。PCP反應條件：96℃3 min；96℃ 1 min；55℃ 1 min，72℃ 30 s，35個循環延伸6 min。擴增H37Rv結核分枝桿菌和卡介苗為對照。PCP產物與Biodyne C膜雜交。通過鏈霉親和素過氧化物酶進行孵育、CDP-star檢測，X線曝光結果。

1.3.2NTF分型 以北京家族為模板，使用MDR-6、MDR-6r正反向引物進行擴增，1.5%瓊脂凝糖膠電泳檢測擴增產物，凝膠成像儀分析，PCR產物片段大小，現代型表現為1 500 bp，古代型表現為302 bp。

1.3.3藥敏實驗和菌種定義 按照結核病診斷細菌學檢驗規程進行菌群鑒定［3］，藥敏實驗按照比例法進行操作，分別將菌群接種在異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素的培養基上（藥物濃度按照絕對濃度法）。

1.4數據分析

使用SPSS 18.0軟件分析包對所得數據進行分析，以（%）表示計數資料、采用χ2檢驗， （x-±s）表示計量資料，采用 t檢驗，P＜0.05差異有統計學意義。

2　結果

2.1菌株基因組成

120株結核分枝桿菌分離株北京家族80株（66.7%），非北京家族40株（33.3%）；18株（15.0%）為獨立型，102株為成簇型（85.0%）；在北京家族的菌株中現代型52株（65.0%），古代型28株（35.0%），非北京家族菌株中T基因型28株（70.0%），非T基因型12株（30.0%）。

2.2北京家族菌株的耐藥性分析

北京家族的現代型菌株對異煙肼、利福平、乙胺丁醇和鏈霉素的耐心藥性分別為7.7%（4/52），9.6%（5/52），9.6%（5/52），11.5%（6/52）；北京家族的古代型菌株對以上藥物的耐心藥性分別為7.1%（2/28），10.7%（3/28），7.1%（2/28），14.3%（4/28）。北京家族的現代型菌株和古代型菌株對異煙肼、利福平、乙胺丁醇和鏈霉素的耐藥性相比差異無統計學意義，P＞0.05。

3　討論

在筆者的研究中，本院的120株結核分枝桿菌分離株中主要以北京家族為主，由于多耐藥性的北京型菌株多次引起爆發性的流行病，因此對于北京型菌株的耐藥性研究為臨床研究的重點［4］。北京家族現代型菌株的耐藥性和古代型菌株的耐藥性差異不顯著，與寧夏、重慶等地的報道中結果相近［5-6］，而貴州地區［7］對北京家族的耐藥性分析中顯示古代型的耐藥性高于現代型差異有統計學意義，筆者認為是地區差異原因。

結核病仍是主要的傳染病之一，有關研究統計［8］，結核分枝桿菌感染率為33.3%左右，全球每年有300萬人死于該疾病。隨著我國衛生狀態的改善，結核病的發病率和死亡率都大大下降，但對于結核病的防治工作仍不能松懈。

［1］ 劉芮汐，李奇志，幸琳琳，等. VNTR-MIUR和spoligotyping用于重慶地區210株兒童結核分枝桿菌臨床分離株的基因分型［J］. 中華流行病學雜志，2011，32（6）：593-597.

［2］ 孫宏莉，徐英春. 結核分枝桿菌檢測實驗室生物安全防護要求［J］. 中國繼續醫學教育，2009，1（3）：74-75.

［3］ 劉桂艷，張煒煜，王博，等. RD105基因缺失法鑒定95株結核分枝桿菌北京基因型及其耐藥相關性分析［J］. 中國衛生工程學，2012，11（5）：363-365.

［4］ 陳春華，劉小琴，王永忠. 結核分枝桿菌臨床分離株分型及耐藥性分析［J］.重慶醫學，2012，41（34）：3641-3642.

［5］ 王曉平，逄宇，趙曉，等. 寧夏回族自治區結核分枝桿菌基因分型及與耐藥性關系的研究［J］. 中國防癆雜志，2013，35（9）：655-659.

［6］ 汪曉艷，趙雁林，逄宇，等. 重慶市結核分枝桿菌臨床分離株的基因分型及相關耐藥性分析［J］. 中國防癆雜志，2013，35（9）：668-672.

［7］ 孫榮，歐維正，王燕，等. 貴州省結核分枝桿菌臨床分離株的基因分型及耐藥性分析［J］. 中國病原生物學雜志，2015，10（12）：1074-1077.

［8］ 韋珍，趙亞楠，武曉琳，等. 結核分枝桿菌臨床分離株耐藥性與耐藥基因突變關系的研究［J］. 臨床肺科雜志，2015，20（7）：1209-1212.

The Genotyping of Mycobacterium Tuberculosis Clinical Isolates and Analysis of Drug Resistance

ZHAO Shujie HAN Lijun ZHAO Zhen'guo Department of Laboratory，Hospital for Infectious Diseases in Changchun City，Changchun Jilin 130000，China

Objective To analyze of Mycobacterium tuberculosis clinical isolates of gene typing and their drug resistance. Methods To collect 120 strains of Mycobacterium tuberculosis isolates in the city. Genotyping was performed using Spoligotyping and PCR methods，and the drug sensitivity test was performed. Results 120 strains of Mycobacterium tuberculosis were mainly in Beijing family，and the modern type was the main type in Beijing family. There was no significant difference in the resistance of the modern and ancient strains of Beijing family strains （P ＞ 0.05）. Conclusion The Mycobacterium tuberculosis in the region has the genetic polymorphism and the main genotype is the Beijing family. There was no significant difference in the drug resistance between theBeijing family and the non Beijing family.

Tuberculosis，Mycobacterium，Genotyping，Drug resistance

R440

A

1674-9316（2016）18-0146-02

10.3969/j.issn.1674-9316.2016.18.096

吉林省衛生廳課題，編號（2013Z067） 作者單位：長春市傳染病醫院檢驗科，吉林 長春 130000