沉默干擾素誘導(dǎo)蛋白16對(duì)人主動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞凋亡的影響

郭 敏鄭中華

沉默干擾素誘導(dǎo)蛋白16對(duì)人主動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞凋亡的影響

郭 敏1鄭中華2

目的 探究沉默干擾素誘導(dǎo)蛋白16（IFI16）對(duì)人主動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞（HAAFs）凋亡的影響。方法 檢測(cè)HAAFs凋亡、IFI16、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）及磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（p-ERK1/2）蛋白表達(dá)。結(jié)果 基因沉默組IFI16低于另兩組（P＜0．05），基因沉默組ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表達(dá)高于另兩組（P＜0．05），陰性對(duì)照組及空白組HAAFs凋亡率、IFI16、ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。結(jié)論 沉默IFI16表達(dá)能夠降低HAAFs凋亡率。

干擾素誘導(dǎo)蛋白16；人主動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞；凋亡

人主動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞（HAAFs）增殖和凋亡的失衡是血管重構(gòu)的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，其增殖與遷移過(guò)程廣泛參與動(dòng)脈粥樣硬化等血管增殖性疾病的發(fā)生與發(fā)展［1］。本次研究IFI16小干擾核糖核酸轉(zhuǎn)染使IFI16基因沉默，抑制IFI16的表達(dá)，探究沉默IFI16對(duì)HAAFs凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

原代HAAFs、成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)染試劑、IFI16小干擾核糖核酸、對(duì)照的小干擾核糖核酸、IFI16抗體、ERK1/2抗體、p-ERK1/2抗體。

1.2 方法

培養(yǎng)HAAFs，取其3～5代細(xì)胞，將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為IFI16小干擾核糖核酸（基因沉默組）、對(duì)照的小干擾核糖核酸（陰性對(duì)照組）及未經(jīng)干擾的HAAFs（空白組）。六孔板中取生長(zhǎng)狀態(tài)較好的HAAFs，使用不含雙抗的成纖維完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)30%～50%后進(jìn)行小干擾核糖核酸轉(zhuǎn)染。添加小干擾核糖核酸轉(zhuǎn)染復(fù)合物干預(yù)6 h，繼續(xù)培養(yǎng)，使用對(duì)照的小干擾核糖核酸檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。提取細(xì)胞蛋白，檢測(cè)蛋白濃度，加入十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白上樣緩沖液，100℃加熱5 min使變性。每孔上樣80 μg蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)移蛋白條帶存在聚偏氟乙稀膜。5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，洗膜，加入一抗工作液，置入4℃冰箱中冷藏至第2 d，洗膜，室溫下孵育稀釋的二抗1 h，洗膜，電致化學(xué)發(fā)光，分析IFI16與內(nèi)參條帶、p-ERK1/2與ERK1/2的吸光度值比。使用Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒I流式細(xì)胞儀檢測(cè)HAAFs凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以SSPS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用 t 檢驗(yàn)，采用表示。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HAAFs凋亡率

基因沉默組、陰性對(duì)照組及空白組HAAFs凋亡率分別為（3.3±0.4）%、（7.4±1.5）%、（6.9±1.1）%，基因沉默組HAAFs凋亡率低于另兩組（P＜0.05），陰性對(duì)照組及空白組差異比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 IFI16、ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表達(dá)

基因沉默組、陰性對(duì)照組及空白組IFI16蛋白表達(dá)為（0.2±0.1）、（1.1±0.3）、（1.0±0.3），基因沉默組IFI16低于陰性對(duì)照組及空白組（P＜0.05），陰性對(duì)照組及空白組差異比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?；虺聊M、陰性對(duì)照組及空白組ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表達(dá)分別為（1.4±0.28）、（1.1±0.25）、（1.1±0.21），基因沉默組ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表達(dá)高于另兩組（P＜0.05），陰性對(duì)照組及空白組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

血管外膜成纖維細(xì)胞是血管外膜的主要細(xì)胞，在血管重構(gòu)中發(fā)揮重要作用［2］，所以，將血管外膜成纖維細(xì)胞作為干預(yù)的靶點(diǎn)對(duì)血管增殖性疾病起到重要防治效果［3］。IFI16在細(xì)胞生長(zhǎng)中起到負(fù)性調(diào)控作用［4］，具有抗增殖效果，對(duì)細(xì)胞凋亡起促進(jìn)作用［5］。干擾素α能誘導(dǎo)IFI16的表達(dá)［6］，抑制人腦血管成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)［7］，IFI16小干擾核糖核酸轉(zhuǎn)染沉默IFI16能夠促進(jìn)人腦血管外膜成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)［8］，所以，人腦血管外膜成纖維細(xì)胞的增值調(diào)控可能與IFI16的表達(dá)有關(guān)。

本次研究顯示，基因沉默組IFI16低于陰性對(duì)照組及空白組（P＜0.05），基因沉默組ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表達(dá)高于陰性對(duì)照組及空白組（P＜0.05），陰性對(duì)照組及空白組HAAFs凋亡率、IFI16、ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），所以，沉默IFI16表達(dá)能夠降低HAAFs凋亡率，其作用機(jī)制與ERK通路有關(guān)。

［1］ 肖燕，吳強(qiáng)． 沉默干擾素誘導(dǎo)蛋白16對(duì)人主動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞凋亡的影響［J］． 貴州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，41（5）： 507-510．

［2］ 李培英，陳云龍，郭益紅，等． 冠脈斑塊形態(tài)與血管活性因子相關(guān)性研究［J］． 中國(guó)繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育，2016，8（12）： 63-64．

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［8］ 黃晶，宋方，龍向淑，等． 干擾素誘導(dǎo)蛋白16對(duì)人腦血管外膜成纖維細(xì)胞增殖與遷移的影響及其機(jī)制［J］． 中國(guó)病理生理雜志，2013，29（4）： 584-589．

Effect of Interferon Inducible Protein 16 on Apoptosis of Human Aortic Outer Membrane Fibroblasts

GUO Min1ZHENG Zhonghua21 Department of Cardiology，Affiliated Hospital of Jilin Medical College，Jilin Jilin 132013，China，2 Pathology and Pathophysiology，Jilin Medical College，Jilin Jilin 132013，China

Objective To explore the effect of silencing interferon inducible protein 16（IFI16）on the apoptosis of human aortic outer membrane fibroblasts（HAAFs）． Methods Detection of HAAFs apoptosis，IFI16 and extracellular regulated protein kinase 1/2（ERK1/2）and phosphorylated extracellular regulated protein kinase 1/2（p-ERK1/2）protein expression． Results Gene silencing of group IFI16 was lower than that of the other two groups（P＜0．05），gene silencing and p-ERK1/2 protein expression in ERK1/2 group was significantly higher than that of the other two groups（P＜0．05），negative control group and blank control group HAAFs，IFI16，ERK1/2 apoptosis and p-ERK1/2 protein expression differences were not statistically significant（P＞0．05）． Conclusion Silencing IFI16 expression can reduce the apoptosis rate of HAAFs．

Interferon inducible protein 16，Human aortic outer membrane fibroblasts，Apoptosis

R972

A

1674-9316（2016）19-0074-02

10．3969/j．issn．1674-9316．2016．19．050

課題項(xiàng)目：吉林省衛(wèi)生廳科研課題（2013Q015）

課題項(xiàng)目：吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院青年醫(yī)師科研課題（2014-3）

1 吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，吉林 吉林 132013 2 吉林醫(yī)藥學(xué)院病理與病理生理學(xué)，吉林 吉林 132013

鄭中華，E-mail：968542868@qq．com