AOPAN納米纖維膜的制備及其固定化漆酶研究

武丁勝,鳳 權,魏安方,李 鑫,姜銀國

(安徽工程大學 安徽省紡織面料重點實驗室,安徽 蕪湖 241000)

AOPAN納米纖維膜的制備及其固定化漆酶研究

武丁勝,鳳 權,魏安方,李 鑫,姜銀國

(安徽工程大學 安徽省紡織面料重點實驗室,安徽 蕪湖 241000)

利用靜電紡絲和偕胺肟化改性制備偕胺肟聚丙烯腈(AOPAN)納米纖維膜,以戊二醛為偶聯劑,其兩端的醛基分別與AOPAN納米纖維膜和漆酶上的氨基反應,進而固定化漆酶.研究了戊二醛交聯條件與固定化漆酶的關系,同時測定了固定化漆酶的相關性能,結果表明,當戊二醛質量分數為5%、處理時間為10 h時,固定漆酶效果最好.對游離漆酶與固定化漆酶進行酶促動力學分析發現,固定化漆酶與底物具有較好的親和性.相對游離漆酶,固定化漆酶對溫度和pH值的變化也表現出更好的穩定性,同時具備良好的儲存穩定性和重復使用能力.固定化漆酶在4 ℃下保存20 d,酶相對活性保持在63.6%以上,固定化漆酶經重復使用10次,酶相對活性保持在65.7%以上.

偕胺肟化改性;偕胺肟聚丙烯腈(AOPAN)納米纖維;固定化漆酶;戊二醛交聯

漆酶(laccase)是一種多酚氧化酶,能夠催化許多酚類化合物發生氧化反應,并使分子氧作為電子受體將其還原成水,其催化底物主要有多酚、甲基替代單酚、芳香胺、苯硫醇、聚甲氧基苯,以及其他容易氧化的化合物等[1-3].因為漆酶具有相當寬泛的底物專一性和較好的穩定性,所以在廢水處理、生物漂白、芳香化合物轉化、生物傳感器構建等方面具有重要的應用價值[4-6].現在大多使用的漆酶主要產生于真菌,在酚類污染物的處理方面,真菌漆酶作為生物催化劑已經顯示了良好的應用前景[7-8].

當前,用于固定漆酶的載體主要是納米顆粒和磁性微球等[9],將偕胺肟化改性的聚丙烯腈(PAN)納米纖維膜通過戊二醛交聯作為固定漆酶的載體則很少有人研究.本文首先利用靜電紡絲技術制備PAN納米纖維膜,通過偕胺肟化改性制備偕胺肟聚丙烯腈(AOPAN)納米纖維膜,然后與戊二醛一端醛基發生反應,制備納米纖維膜固定漆酶載體,最后利用納米纖維膜載體中的醛基與酶的氨基反應固定漆酶.同時,研究了戊二醛的質量分數和處理時間對固定漆酶效果的影響,對比分析了固定化漆酶與游離漆酶的各種性能差異.

1 試 驗

1.1 材料及儀器

PAN(粉末狀,相對分子質量為90 000)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、鹽酸羥胺、乙酸(36%)、乙酸鈉、碳酸鈉、磷酸(85%)、乙醇(95%)、考馬斯亮藍(G-250),均為分析純,購于國藥試劑網;戊二醛(GA、50%)、愈創木酚,購于阿拉丁試劑網;漆酶(米曲霉菌種),購于安徽酷爾生物科技有限公司.

自制靜電紡絲裝置(主要包括注射器、注射泵、高壓直流電源、納米纖維接收裝置);S-4800型掃描電子顯微鏡(日本日立公司);IR Prestige-21型傅里葉紅外光譜儀(日本島津公司);UV-5500型紫外可見分光光度計(上海普析科學儀器有限公司).

1.2 AOPAN納米纖維膜的制備

將PAN粉末溶于DMF溶劑中,制備質量分數為 12%的PAN靜電紡絲液. 將紡絲液倒入注射器(規格為10 mL)中,將磨平的針頭(規格為7 號)與注射器連接;環境溫度為(20±1) ℃,相對濕度為(60±5)%.根據紡絲效果,分別設定流速、接收距離、紡絲電壓等工藝參數,靜電紡絲時間為10～15 h,將收集的納米纖維膜在40 ℃條件下的烘箱中烘干120 min,備用.將1 g PAN納米纖維膜放于濃度為0.2 mol/L、pH值為7、溫度為65 ℃的鹽酸羥胺溶液中浸泡2 h,再用蒸餾水清洗5次,在40 ℃條件下真空干燥2 h,制備AOPAN納米纖維膜.同時精確稱量反應后納米纖維膜質量,計算偕胺肟轉化率[10].PAN納米纖維偕胺肟化改性示意圖如圖1所示.

圖1 偕胺肟化反應示意圖

Fig.1 Schematic of amidoxime reaction

1.3 AOPAN納米纖維膜固定漆酶

準確稱量0.01 g AOPAN納米纖維膜(干重),放入一定質量分數的戊二醛溶液中,在25 ℃、40 rad/min條件下慢速振蕩,進行一定時間的反應,再用蒸餾水洗去多余戊二醛,將戊二醛改性后的納米纖維膜浸泡在50 mL、3 g/L漆酶溶液(以pH值為4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液配置)中,在4 ℃下固定12 h.將固定有漆酶的AOPAN納米纖維膜用醋酸-醋酸鈉緩沖液多次洗滌,直至洗滌液中檢測不到漆酶為止,將固定化漆酶于4 ℃條件下儲存于上述緩沖液中.AOPAN納米纖維膜固定漆酶原理如圖2所示.

圖2 AOPAN納米纖維膜固定漆酶示意圖Fig.2 Schematic of AOPAN nanofibrous membrane immobilized laccase

1.4 漆酶固定量和活性測定

采用Bradford方法測定AOPAN納米纖維膜對漆酶的固定量.通過測定固定化前后的酶溶液以及清洗固定化酶膜所用醋酸-醋酸鈉緩沖液中漆酶的含量,按式(1)計算漆酶的固定量(Ge).

(1)

式中:Ge為漆酶固定量(mg/g);C0為固定前酶溶液中漆酶含量(mg/mL);C1為固定后酶溶液中漆酶含量(mg/mL);C2為沖洗固定化酶膜醋酸-醋酸鈉緩沖液中漆酶的含量(mg/mL);V0為固定化試驗所用酶溶液的體積(mL);V2為沖洗固定化酶膜所用醋酸-醋酸鈉緩沖液的體積(mL);m為用于固定化酶的AOPAN納米纖維膜的質量(g,干重).

將0.3 mL自由漆酶溶液(3 g/L)及成功固定漆酶的納米纖維膜(準確稱量0.01 g)分別放入8.7 mL、濃度為10 mmol/L的愈創木酚溶液,在50 ℃下反應30 min,于波長465 nm處測試愈創木酚吸光度的變化.漆酶活性單位(U)定義為單位時間內每毫克酶所催化的愈創木酚微摩爾數.漆酶活性計算如式(2)所示.

(2)

式中:v為漆酶活性 (U);A0為初始愈創木酚溶液的吸光度;A為反應一段時間后愈創木酚溶液的吸光度;V1為愈創木酚溶液的體積 (mL);t為反應時間 (min);K為愈創木酚的摩爾消光系數(1.2×104L/(mol·cm) );mw為漆酶的質量(mg).

1.5 游離漆酶與固定化漆酶性能測試

1.5.1 漆酶最適反應溫度和pH值

為測定固定化漆酶的最適反應溫度,將游離漆酶和固定化漆酶樣品放于pH值為4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液中,在溫度為30～70 ℃的條件下,測定漆酶活性.以最高活性為 100%,得出相對活性.

為測定固定化漆酶的最適反應pH值,分別配置pH值為2～7的醋酸-醋酸鈉緩沖液各50 mL,將游離漆酶和固定化漆酶樣品分別放于上述不同pH值的緩沖液中,測試漆酶活性.以最高活性為 100%,得出相對活性.

1.5.2 漆酶的穩定性

為測試漆酶的儲存穩定性,將一批處于濕態的固定化漆酶膜和游離漆酶溶液放置于4 ℃下保存,每隔一段時間取出一份樣品測定其活性.通過考察漆酶相對活性的變化,研究漆酶的儲存穩定性.

為測定固定化漆酶的重復使用性能,將固定化漆酶膜放入10 mmol/L、pH值為4.5的愈創木酚反應液中,在50 ℃下反應30 min,取出納米纖維膜用醋酸-醋酸鈉緩沖液清洗,然后再加入到新的相同愈創木酚反應液中,在相同條件下重復反應,以首次使用時酶活性為100%,測定每次重復使用后酶相對活性.

1.6 形態及結構表征

(1) 納米纖維膜形態觀察.在真空狀態下,對待測的納米纖維膜表面進行噴金處理,采用掃描電子顯微鏡觀察纖維的表面形態.

(2) 納米纖維膜紅外光譜分析.采用溴化鉀壓片制樣法對 PAN 納米纖維膜、AOPAN納米纖維膜進行紅外光譜分析.

2 結果與討論

2.1 AOPAN納米纖維膜表征

2.1.1 納米纖維膜形貌分析

通過掃描電子顯微鏡觀察PAN納米纖維膜在偕胺肟化改性前后表面形態變化,其結果如圖3所示.由圖3(a)可知,靜電紡絲制備的PAN 納米纖維膜是由隨機排列的納米纖維組成,纖維成型良好,直徑較為均一;由圖3(b)可知,偕胺肟化改性制備的AOPAN納米纖維(轉化率為32.8%)依然保持良好的形態,纖維直徑均勻,且結構并沒有發生明顯的變化,但其表面變得有些粗糙.

(a) PAN

2.1.2 納米纖維膜紅外光譜分析

圖4 PAN和AOPAN納米纖維膜紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectroscopy of the PAN and AOPAN nanofibrous membrane

2.2 交聯條件對固定漆酶的影響

2.2.1 戊二醛質量分數對固定漆酶的影響

準確稱取7組0.01 g AOPAN納米纖維膜放于樣品瓶中,加入20 mL質量分數為1%～7%的戊二醛溶液,在25 ℃、40 rad/min條件下慢速振蕩10 h,取出納米纖維膜用蒸餾水洗去多余戊二醛,分別放入50 mL、3 g/L的漆酶溶液中,在4 ℃下固定12 h.然后分別測試不同條件下的漆酶固定量及酶活性,以游離漆酶活性為100%,用固定化酶相對活性表示漆酶活性,每組試驗測試3次,求平均值,結果如圖5所示.由圖5可以看出,隨著戊二醛質量分數的增加,漆酶的固定量也在逐漸增加,固定化酶的活性大致保持不變;當戊二醛的質量分數達到5%時,漆酶固定量達到最大值(73.64 mg/g,干重),再繼續增加戊二醛,漆酶的固定量開始出現下降,固定化漆酶的活性也開始下降.

2.2.2 戊二醛反應時間對固定漆酶的影響

圖5 戊二醛質量分數與酶固定量和酶相對活性關系Fig.5 Relationship between the mass fraction of glutaraldehyde and the amount of enzyme and relative activity of enzyme

準確稱取7組0.01 g AOPAN納米纖維膜放于樣品瓶中,加入20 mL質量分數為5%的戊二醛溶液,在25 ℃、40 rad/min條件下振蕩不同時間,然后用蒸餾水洗去多余戊二醛,之后與2.2.1節操作相同,結果如圖6所示.由圖6可以看出,隨著戊二醛處理時間的延長,酶固定量在逐漸增加,固定化酶的相對活性變化不大,當處理時間為10 h時,酶固定量達到最大,再延長處理時間,酶的固定量和酶的活性開始變小.因為AOPAN納米纖維膜上的氨基與戊二醛一端的醛基反應需要一定時間[11],反應10 h時效果最好,如果再增加反應時間會引發副反應,從而降低酶固定量和固定化酶活性.

圖6 處理時間與酶固定量和酶相對活性關系Fig.6 Relationship between treatment time and the relative activity of enzyme and amount of enzyme

2.3 AOPAN納米纖維膜固定化漆酶動力學分析

通過測定酶催化反應中的米氏常數能夠很好地解釋酶促反應現象.用Lineweaver-Burk雙倒數法可求解動力學參數,即將米氏方程變為倒數形式,如式(3)所示.

(3)

式中:v0為初始反應速率;[S]為底物濃度;Km為米氏常數,在固定化酶中,Km也體現了酶與固定化載體間的親和性;vmax為酶在底物過量時的最大反應速率.

在醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH值為4.5)于50 ℃條件下測試動力學參數,以愈創木酚為反應底物,底物濃度在0.5～10 mmol/L之間變化,反應30 min,分別測定游離漆酶與固定化漆酶的最大反應速率,測試結果如表1所示.

表1 游離漆酶和固定化漆酶的動力學參數Table 1 Kinetic parameters of free laccase and immobilized laccase

與游離漆酶相比,漆酶經AOPAN納米纖維膜固定化后,其米氏常數Km值有所增加,表示漆酶與底物的親和性有所下降,但相對其他載體固定化漆酶而言,其仍體現出與載體良好的親和性[12].另外,漆酶的構象雖然因為交聯而受到約束,但其vmax值降低較小.

2.4 固定化漆酶的性能

2.4.1 最適反應溫度和pH值

漆酶作為一種高效生物催化劑,其活性很容易受到環境中的酸堿度和溫度的影響,在不同溫度和pH值的條件下,分別對游離漆酶和固定化漆酶進行酶活性測試,測試結果如圖7所示.由圖7(a)可知,游離漆酶的最適pH值為4.5,而固定化漆酶的最適pH值為4.0,而且固定化漆酶對于pH值的變化其性能更穩定.這是因為AOPAN納米纖維膜經交聯法固定化漆酶使其構像更加穩定,當 pH 值在一定范圍內變化時,體現出比游離漆酶更穩定的催化性能.由圖7(b)可知,固定化漆酶的最適溫度為55 ℃,較游離漆酶上升5 ℃,并且從整體上看,固定化漆酶對溫度變化表現出更好的穩定性.這是因為通過交聯法固定化酶時,酶大分子與戊二醛交聯的納米纖維形成多點連接,從而在一定程度上穩定了漆酶的構象,能防止酶因受熱而發生肽鏈折疊及伸展變形而影響酶的活性[13].

(a) pH值

(b) 溫度圖7 游離漆酶和固定化漆酶的相對活性與pH值和溫度關系Fig.7 Relationship between the relative activity of free laccase and immobilized laccase with pH value and temperature

2.4.2 固定化漆酶的穩定性

本文主要從固定化漆酶的重復使用能力和儲存能力來研究固定化漆酶的穩定性.當固定化漆酶在pH值為4.5、溫度為50 ℃的條件下,前5次重復使用中,酶相對活性一直保持在85%以上;當固定化漆酶在相同條件下重復使用10次時,其相對活性保持在65.7%以上.由此表明,AOPAN納米纖維膜固定化漆酶具有良好的重復使用能力.游離漆酶和固定化漆酶的儲存穩定性對比如圖8所示.

圖8 游離漆酶與固定化漆酶的儲存穩定性對比Fig.8 Storage stability of free laccase and immobilized laccase

由圖8可知,游離漆酶在4 ℃下儲存20 d以后,其相對活性只有35.5%左右,然而在同樣條件下,固定化漆酶相對活性還保持在63.6%以上,說明固定化漆酶具有良好的儲存穩定性.因為交聯法固定化漆酶形成的碳氮雙鍵使漆酶的結構更加穩定,漆酶的性能變得更穩定[14].

3 結 語

本文以AOPAN納米纖維膜為載體通過戊二醛交聯固定漆酶,當戊二醛質量分數為5%,反應時間為10 h時,固定漆酶效果最好,漆酶的固定量達到73.64 mg/g,而且此時漆酶的相對活性也達到最大.

通過測試固定化漆酶與游離漆酶的性能發現,隨著反應溫度及pH值的變化,固定化漆酶體現出更好的穩定性.動力學分析結果也表明,AOPAN納米纖維膜載體與漆酶之間具有良好的生物親和性.試驗結果同時表明,固定化漆酶經10次重復使用,其相對活性能保持在65.7%以上,固定化漆酶在4 ℃條件下儲存20 d后,其相對活性還能保持在 63.6%以上,而游離漆酶在相同條件下只保留35.5%的活性.

[1] WANG Q Q,PENG L,DU Y Z,et al. Fabrication of hydrophilic nanoporous PMMA/O-MMT composite microfibrous membrane and its use in enzyme immobilization[J]. Journal of Porous Materials,2013,20: 457-464.

[2] 張平,王清清,張金寧,等. 金屬配合纖維對漆酶固定化的影響[J]. 功能材料,2013,23(44): 3442-3446.

[3] FERNANDEZ-FEENANDEZ M,SANROMAN M A,MOLDES D. Recent developments and applications of immobilized laccase[J]. Biotechnology Advances,2013,31: 1808-1825.

[4] GARCIA-GALAN C,BERENGUER-MURCIA A,FEMANDEZ-LAFUENTE R,et al. Potential of different enzyme immobilization strategies to improve enzyme performance[J]. Advanced Synthesis &Catalysis,2011,353: 2885-2904.

[5] LI Y,HUANG X,QU Y. A strategy for efficient immobilization of laccase and horseradish peroxidase on single-walled carbon nanotubes[J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology,2013,88: 2227-2232.

[6] LI Y,ZHANG J,HUANG X,et al. Construction and direct electrochemistry of orientation controlled laccase electrode[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications,2014,446: 201-205.

[7] 劉忠川,王剛剛. 真菌漆酶結構與功能研究進展[J]. 生物物理學報,2013,29(9): 629-645.

[8] 曾涵,廖鈴文,李明芳,等. 聚芳酰胺-多壁碳納米管混合物固定漆酶電極的電化學行為[J]. 物理化學學報,2010,26(12): 3217-3224.

[9] 王苗苗,李群艷,韋奇. 介孔SiO2/Fe3O4中空磁性微球的漆酶固定化[J]. 高等學校化學學報,2013,34(2): 299-305.

[10] 鳳權,侯大寅,畢松梅. AOPAN納米纖維金屬離子配合性能及動力學分析[J]. 東華大學學報(自然科學版),2015,41(2): 143-147.

[11] 王穎,張笛,茹加,等. 殼聚糖固定化漆酶酶學性質及其催化氧化水中2,4-二氯酚的效能與途徑[J]. 環境化學,2013,32(10): 1901-1908.

[12] WANG Q Q,CUI J,LI G. H,et al. Laccase immobilized on a PAN/adsorbents composite nanofibrous membrane for catechol treatment by a biocatalysis/adsorption process[J]. Molecules， 2014,19: 3376-3388.

[13] BEN Y S,BOUALLAGUI Z,SAYADI S,et al. Catalytic behavior and detoxifying ability of an atypical homotrimeric laccase from the thermophilic strain Scytalidium thermophilum on selected azo and triarylmethane dyes[J]. Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic,2012,79: 41-48.

[14] 楊波,張麗媛,馮利東. 固定化漆酶對水中鄰苯二胺的去除研究[J]. 安全與環境學報,2012,12(2): 32-36.

Study on Preparation of AOPAN Nanofibrous Membrane and Its Immobilized Laccase

WUDing-sheng,FENGQuan,WEIAn-fang,LIXin,JIANGYin-guo

(Anhui Provincial Key Laboratory of Textile Fabric,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

Amidoxime ployarcylonitrile(AOPAN) nanofibrous membrane was prepared by electrospinning and amidoxime modification. Glutaraldehyde was used as a coupling agent,as its both ends of the aldehyde groups reacted with amino groups of AOPAN nanofibrous membrane and laccase,respectively,in this way using for enzyme immobilization. The relationship between the condition of glutaraldehyde cross-linked and the immobilized laccase was studied,and the relative properties of the immobilized laccase were also determined. Results show that when the mass fraction of glutaraldehyde is 5%,the processing time is 10 h,the immobilized laccase has the best effect. The kinetics analysis of free laccase and immobilized laccase show that the immobilized enzyme and substrate affinity is excellent. Compared with free laccase,the immobilized laccase show a better stability for the change of temperature and pH value,it also has good storage stability and reusability. The immobilized laccase can be kept for 20 d at 4 ℃,and the relative activity of enzyme can be maintained more than 63.6%,and the relative activity of enzyme can be kept more than 65.7% after repeated use 10 times.

amidoxime modification;amidoxime polyarcylonitrile(AOPAN) nanofiber;immobilized laccase;glutaraldehyde crosslinking

1671-0444 (2016)05-0693-06

2016-03-02

國家自然科學基金資助項目(21377004)；安徽省自然科學基金資助項目(1408085ME87)；安徽省高校自然科學研究資助項目(KJ2016SD04，KJ2015A022)；安徽省高校優秀青年人才支持計劃資助項目

武丁勝(1989—)，男，安徽阜陽人，碩士研究生，研究方向為功能性紡織品的開發.E-mail: wudingsheng282@126.com 鳳 權(聯系人)，男，副教授，E-mail: fengquan@ahpu.edu.cn

TQ 342

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