新型靶向藥物拉帕替尼對人卵巢癌細胞SKOV3的影響

王 玥

中南大學藥學院 湖南省長沙市 410083

新型靶向藥物拉帕替尼對人卵巢癌細胞SKOV3的影響

王 玥

中南大學藥學院 湖南省長沙市 410083

目的：分析新型靶向藥物拉帕替尼對人卵巢癌細胞SKOV3的影響，評價拉帕替尼在卵巢癌治療中的價值。方法：采用體外實驗研究，培養(yǎng)人卵巢癌細胞株SKOV3，進行分組，包括低中高實驗組、對照組、模型組，采用流式細胞儀分析細胞周期，采用MTT方法檢測細胞活力。結果：實驗組人卵巢癌細胞SKOVS細胞活力、細胞周期與對照組、模型組組間比較存在顯著差異（P＜0.05），低、中、高劑量實驗組指標呈現(xiàn)階梯變化。結論：拉帕替尼對人卵巢癌細胞SKOV3細胞增殖具有明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)劑量依賴。

拉帕替尼；卵巢癌；靶向藥物

卵巢是腫瘤好發(fā)部位，卵巢癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，我國發(fā)病率約為7‰～10‰，多見于圍絕經(jīng)期女性，近年來卵巢癌發(fā)病率呈上升趨勢。卵巢癌危害較大，我國卵巢癌死亡率約為1.45/10萬，是死亡率最高的惡性腫瘤，高于宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌[1]。卵巢癌發(fā)病、進展機制較復雜，治療難度大，近年來有關于卵巢癌的發(fā)病生物學、分子學機制研究越來越深入，以表皮生長因子受體（EGFR）為靶點的藥物，并開始用于臨床[2]。拉帕替尼是一種經(jīng)典的以EGFR為靶點的抑制劑，其應用時間相對較晚，本次研究試以人卵巢癌細胞SKOV3作為研究對象，分析其對細胞生長的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

人卵巢液性乳頭狀囊腺癌細胞株SKOV3，醫(yī)學實驗中心提供，10%胎牛血清培養(yǎng)。拉帕替尼，大連美侖生物技術公司提供。胰蛋白酶、二甲基亞砜、胎牛血清等。倒置相差顯微鏡，熒光顯微鏡，超凈工作臺，Epics流式細胞儀，低溫冰箱等。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

取液氮凍存細胞，37℃溫水中解凍，超凈工作臺上操作，將細胞移入離心管，加入10倍RPMI-1640培養(yǎng)液，離心，800rpm/min,離心5～10min，棄上清，細胞沉淀加PRMI-1640培養(yǎng)液，搖勻，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待目標細胞生長到80%～90%培養(yǎng)瓶，棄培養(yǎng)液，采用PBS緩沖液漂洗兩遍，倒置顯微鏡鑒定合格，加入培養(yǎng)液胰酶消化液，將已經(jīng)消化過的細胞脫離培養(yǎng)瓶，800rpm/min,5min,棄上清，顯微鏡下細胞計數(shù)，進行1:3比例傳代培養(yǎng)，分裝至培養(yǎng)瓶。取對數(shù)生長周期細胞0.25%胰蛋白酶消化離心，PSB漂洗2次，1000rpm離心，5min，棄上清，加入-20℃DMSO細胞凍存液，移入凍存管，4℃靜置30min，-20℃保存2h，轉入-80℃超低溫冰箱，長期保存著24h后轉移到-80℃液氮中。

1.2.2 分組

低中高實驗組、對照組、模型組。將培養(yǎng)得到的細胞株，1000rpm離心5min，PBS漂洗1次，棄上清，調(diào)整密度為8×104/ml。取接3個96孔板，每個時間點1板，100μl/孔，每個孔104，做好分組標記。低中高實驗組加入濃度分別為20、30、60μmol/L拉帕替尼，對照組只含有等量的溶劑，模型組不做任何處理。37℃，5%CO2,條件下培養(yǎng)24h，時間到后，去上清液，每孔加入5g/L的MTT共10μl，常規(guī)處理，在微板測試系統(tǒng)上，在490nm波長處測定各孔光密度OD值，計算細胞抑制率。培養(yǎng)48h后，采用PI染色法流式細胞技術測定細胞周期。

1.3 統(tǒng)計學處理

以WPS xls數(shù)據(jù)表錄入數(shù)據(jù)，采用SPSS18.0軟件進行數(shù)學處理，計量資料以均數(shù)±標準差描述統(tǒng)計，采用柯爾莫哥羅夫-斯米爾諾夫（Kolmogorov-Sminmov）檢驗法進行正態(tài)性檢驗，服從正態(tài)分布組間比較采用t檢驗或方差分析，若不服從正態(tài)分布采用非參數(shù)統(tǒng)計Mann-Whitney U秩和檢驗，計數(shù)資料以數(shù)（n）或率（%）描述統(tǒng)計，組間比較采用X2檢驗，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

實驗組各劑量亞組、對照組、模型組OD與抑制率組間比較存在顯著差異（P<0.05），低、中、高劑量實驗組指標呈現(xiàn)階梯變化。見表1。

實驗組各劑量亞組、對照組、模型組G0/G1、S、G2/M水平組間比較存在顯著差異（P<0.05），低、中、高劑量S、G2/ M實驗組指標呈現(xiàn)階梯變化。見表1。

3 討論

本次研究證實，拉帕替尼對人卵巢癌細胞SKOV3的細胞周期、活性具有顯著影響。實驗組各劑量亞組、對照組、模型組OD與抑制率組間比較存在顯著差異（P<0.05），低、中、高劑量實驗組指標呈現(xiàn)階梯變化，提示各拉帕替尼在體外可明顯抑制人卵巢癌細胞SKOV3的活性，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴。同理，拉帕替尼在體外可明顯抑制人卵巢癌細胞細胞生長，降低S期比重，將細胞阻滯在G0/G1周期，眾所周知，卵巢癌細胞周期直接影響患者的預后[3]。目前關于拉帕替尼的體外癌細胞作用研究并不少見，但主要集中在乳腺癌上，理論上其不僅僅可對卵巢癌細胞產(chǎn)生顯著的抑制作用，在肝癌等其他惡性腫瘤細胞中也會發(fā)揮重要[4]。

拉帕替尼的研發(fā)企業(yè)經(jīng)大量的研究證實，該藥可逆性結合EGFR、HER2受體，這些受體位于細胞區(qū)域ATP結合位點，這一結構與絲裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇3激酶等信號通路關系密切，最終影響細胞的分裂、增殖、分化、遷移。眾所周知，惡性腫瘤最大的特征在于惡性的分裂、增殖、分化、遷移，這也是惡性腫瘤難治的根本原因，拉帕替尼通過這一靶點[5]，通過影響MAPK、PICK等信號通路，從而抑制腫瘤活動。近年來個體化治療越來越受到重視，極大的提高了惡性腫瘤的治療水平，鑒于拉帕替尼的作用機制，其對HER2過度表達的轉移晚期乳腺癌療效肯定，目前關于拉帕替尼治療卵巢癌的臨床研究并不多見，卵巢癌拉帕替尼靶點HER2過度表達率約為25%～32%，處于較高水平，理論上采用拉帕替尼具有一定的療效[6]。Kimball等對卵巢癌的Ⅰ期間臨床研究證實，拉帕替尼聯(lián)合卡鉑治療復發(fā)性卵巢癌的敏感性療效較好[7]。目前，拉帕替尼主要通過與卡培他濱聯(lián)合治好了，曾經(jīng)接受蒽環(huán)類、紫杉類藥物化療，以及曲妥珠單抗治療失敗，HER2過度表達晚期以及轉移性乳腺癌治療，其對卵巢癌療效研究有待深入。卵巢癌死亡率相對更高，患者晚期生存時間短，一定程度上限制了拉帕替尼的應用。此外，不同于乳腺癌，HER2在卵巢癌中的表達雖然較高，但是在良性卵巢中的表達也較高，其在卵巢癌發(fā)生、進展、轉移中的作用可能并不突出，目前關于卵巢癌靶點研究集中在熱休克蛋白、錳超氧化物歧化酶等因子上[8]。

表1：實驗組、對照組于模型組培養(yǎng)24h后OD、抑制率對比

表2：實驗組、對照組于模型組培養(yǎng)48h后細胞周期分布

需注意的是，人體正常細胞也有大量的HER2表達，拉帕替尼與其他生長因子受體靶點藥物一樣，也存在不良反應，已知的不良反應主要包括腹瀉、惡心、嘔吐、手足綜合征、左室射血分數(shù)下降、間質性肺炎等[9]。近年來，拉帕替尼在乳腺癌廣泛應用也出現(xiàn)了耐藥問題，為防范于未然，也有必要深入研究其在卵巢癌中的作用機制，提高合理應用水平，避免過早出現(xiàn)耐藥[10]。

綜上所述：拉帕替尼對人卵巢癌細胞SKOV3細胞增殖具有明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)劑量依賴，但缺乏臨床研究證實，其體內(nèi)作用機制有待深入研究。

[1]謝幸，茍文麗.婦產(chǎn)科學（第8版）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2013:327-328.

[2]陳銳,李庭芳,董志紅等.絕經(jīng)后卵巢腫瘤610例臨床病理分析[J].中國婦幼保健,2011,26(34):5370-5372.

[3]周立香，張虹.Ⅲ期上皮性卵巢癌復發(fā)的相關因素分析[J].天津醫(yī)藥,2013,41(01):41-43.

[4]姜秋紅,程能能,離惠君.ER、PR、CA125、Ik67及P53的表達對上皮性卵巢癌化療敏感性的預測作用[J].中國臨床藥學雜志,2012,25(06):354-358.

[5]Ahn ER,Vogel CL.Dual HER2-targeted approaches in HER2-positive breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat, 2012,131(02):371-383.

[6]Lui VW, Lau CP, Ho K, et al. Anti-invasion, antiproliferation and anoikissensitization activities of lapatinib in nasopharyngeal carcinoma cells[J].Invest New Drugs,2011,29(06):1241-1252.

[7]Kimball KJ,Numnum TM,Kirby TO,et al.A phase I study of lapatinib in combination with carboplatin in women with platinum sensitive recurrent ovarian carcinoma[J]. Gynecol Oncol,2008,111(01):95-101.

[8]李衛(wèi),何援利,米登海.錳超氧化物歧化酶模擬化合物誘導人卵巢上皮癌細胞株SKOV3凋亡的研究.中國臨床醫(yī)學,2013,20(01):14-16.

[9]陳婕,儲文功,潘建玲.拉帕替尼引起胃腸道不良反應與相關基因的關聯(lián)性研究[J].藥物流行病學雜志,2016,25(06):359-362.

[10]李喆,常濤,石林祥,等.ERa通路代償性激活在乳腺癌細胞的拉帕替尼獲得性耐藥中的作用[J].第二軍醫(yī)大學學報,2013,34(09):616-622.