ADV分離強(qiáng)毒株全基因突變重組質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)及其免疫原性的分析

孫利杰,劉東旭，李健明，時(shí)坤，冷雪，李東，杜銳

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生院，長(zhǎng)春 130118)

ADV分離強(qiáng)毒株全基因突變重組質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)及其免疫原性的分析

孫利杰1,劉東旭1，李健明1，時(shí)坤1，冷雪1，李東1，杜銳2*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生院，長(zhǎng)春 130118)

為研制水貂阿留申病核酸疫苗, 應(yīng)用重疊延伸PCR技術(shù)去除ADV VP2基因中編碼428～446位氨基酸的核苷酸序列，與pcDNA3.1(+)載體連接，構(gòu)建全基因突變重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ADV-428，在此基礎(chǔ)上，截去編碼487～501位氨基酸的核苷酸序列，構(gòu)建全基因突變重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ADV-428-487。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)肌肉注射免疫小鼠, 應(yīng)用間接 ELISA法檢測(cè)接種后14、28、42、56 d抗ADV抗體水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)接種后第42天小鼠脾細(xì)胞CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群。結(jié)果顯示，小鼠接種質(zhì)粒后CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量均明顯增加,第42天抗ADV抗體水平達(dá)峰值。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)ADV全基因突變重組質(zhì)粒的免疫原性進(jìn)行分析，為水貂阿留申病核酸疫苗的研制提供了參考。

水貂阿留申病毒；真核表達(dá)載體；反應(yīng)原性；免疫原性

水貂阿留申病(Aleutian disease of mink,AD)是制約水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要疾病[1]，具有阿留申基因型的水貂甚至有1/3死于該病[2]。水貂感染水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus,ADV)后，病毒可在體內(nèi)持續(xù)感染引發(fā)強(qiáng)烈的體液免疫，出現(xiàn)高水平的特異性抗體以及自身抗體，但抗體不能中和這些病毒，反而會(huì)形成抗原抗體復(fù)合物[3-5]，引發(fā)抗體依賴性增強(qiáng)(Antibody dependent enhancement, ADE)，即特異性抗體的存在可增強(qiáng)病毒的感染，這也是ADV致宿主免疫功能紊亂及絕大多數(shù)AD疫苗免疫失敗的主要原因之一。抗原抗體復(fù)合物在貂體內(nèi)不能被清除，隨血液循環(huán)流動(dòng)，最終在腎小球及其他器官動(dòng)脈管壁的基底膜形成沉淀，損傷腎小球及其他組織，表現(xiàn)為腎小球腎炎和動(dòng)脈血管炎等[6-8]。因該病致病機(jī)理特殊，研制開(kāi)發(fā)針對(duì)ADV的疫苗，一直是動(dòng)物醫(yī)學(xué)界很棘手的問(wèn)題[9]。

目前開(kāi)展的水貂阿留申病疫苗研究主要包括滅活苗、VP2亞單位疫苗及針對(duì)NS1的核酸疫苗，而這些疫苗對(duì)水貂阿留申病毒感染不具有或僅具有部分保護(hù)作用。DNA疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比，具有很多優(yōu)勢(shì)，針對(duì)水貂阿留申病的DNA疫苗的研究也越來(lái)越多，但目前還沒(méi)有能有效防控水貂阿留申病的DNA疫苗。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)ADV分離強(qiáng)毒株全基因組中與抗原抗體復(fù)合物形成有關(guān)的片段和介導(dǎo)ADE反應(yīng)的相關(guān)片段進(jìn)行切除、重組，構(gòu)建重組質(zhì)粒，通過(guò)對(duì)重組質(zhì)粒的反應(yīng)原性和免疫原性的檢測(cè)，以期為后續(xù)試驗(yàn)和針對(duì)水貂阿留申病核酸疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 病毒、載體和細(xì)胞 水貂阿留申病病毒強(qiáng)毒株由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室分離及保存；pcDNA3.1/V5HisA真核表達(dá)載體購(gòu)于invitrogen公司；L929細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒FuGENE?HD購(gòu)自Promega公司；DNA Marker、限制性內(nèi)切酶KPnI和NotI、T4DNA連接酶，均購(gòu)自TaTaRa生物工程有限公司；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒，均為杭州維特潔生化技術(shù)有限公司產(chǎn)品；FITC標(biāo)簽的兔抗水貂抗體及HRP標(biāo)記的兔抗水貂抗體購(gòu)自北京博奧森公司；細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BiLegend公司。

2 方法

2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 利用DNA-star軟件，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室所分離保存的ADV強(qiáng)毒株全基因序列，應(yīng)用重疊延伸PCR原理設(shè)計(jì)引物，對(duì)應(yīng)去除vp2區(qū)域中主要抗原表位及抗原抗體復(fù)合物結(jié)合位點(diǎn)428～446位氨基酸，同時(shí)去除潛在的抗原抗體復(fù)合物結(jié)合位點(diǎn)487～501位氨基酸。應(yīng)用Primer5.0設(shè)計(jì)3對(duì)引物，并在全長(zhǎng)引物中添加KPnI和NotI酶切位點(diǎn)(下劃線部分)。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。

2.2 突變?nèi)蛘婧酥亟M質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

2.2.1 切除428～446位氨基酸全基因真核重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以總上和428為上下游引物，實(shí)驗(yàn)室所保存的ADV分離強(qiáng)毒株DNA為模板，PCR擴(kuò)增大小約為3600 bp的目的片段。PCR擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 1 min，63.5 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min，35循環(huán)，72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r(shí)以446和總下為上下游引物，擴(kuò)增大小約為870 bp目的片段。PCR擴(kuò)增程序如下:95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 1 min，62.7 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min，35循環(huán)，72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 各段上下游引物

以兩段PCR產(chǎn)物為模板，總上和總下為引物，進(jìn)行重疊延伸PCR，將兩段PCR產(chǎn)物進(jìn)行融合。PCR程序如下：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，68.3 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min，30循環(huán)，72 ℃ 7 min 4 ℃保存?zhèn)溆谩⑷诤袭a(chǎn)物和pcDNA3.1(+)載體，同時(shí)用KPnI和NotI酶進(jìn)行雙酶切，在T4DNA酶的作用下進(jìn)行連接，構(gòu)建全基因突變重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ADV-428。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白色菌落，經(jīng)鑒定后的重組質(zhì)粒送至上海生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2.2.2 切除428～446位和487～501位氨基酸全基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以總上和487為上下游引物，全基因突變重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ADV-428為模板，擴(kuò)增大小約為3750 bp片段，擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 1 min，62.7 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min，35循環(huán)，72 ℃ 7 min 。PCR產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以501和總下為上下游引物，pcDNA3.1-ADV-428重組全基因?yàn)槟０澹瑪U(kuò)增大小約為700 bp片段，擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 1 min，60.7 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min，35循環(huán)，72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將以上兩段PCR產(chǎn)物進(jìn)行融合，同方法2.2.1項(xiàng)，構(gòu)建全基因突變重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ADV-428-487。

2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的免疫熒光檢測(cè) 將L929細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中, 在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)過(guò)夜, 待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí),按照FuGENE?HD 轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作：將純度OD260/280達(dá)到1.7～1.9的2種重組質(zhì)粒分別和轉(zhuǎn)染試劑以1∶2的比例混合轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞, 在37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng),同時(shí)設(shè)空質(zhì)粒對(duì)照組和空白細(xì)胞對(duì)照組。用常規(guī)間接免疫熒光法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物：轉(zhuǎn)染48 h后，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，PBS洗滌后用冷乙醇于-20 ℃固定30 min；5%血清封閉2 h；漂洗后加入阿留申陽(yáng)性血清(150倍稀釋)37 ℃作用1 h；PBS洗滌3次；以FITC標(biāo)記的兔抗水貂抗體為二抗(1000倍稀釋)37 ℃作用1 h。置于熒光顯微鏡下觀察[10-11]。

2.4 動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn) 選取健康小鼠隨機(jī)分為5組。A：pcDNA3.1-ADV-428組；B：pcDNA3.1-ADV-428-487組；C: 滅活疫苗組；D：空載體組；E: PBS空白組。分別在第0、14和28天肌肉注射免疫，A、B、D組質(zhì)粒接種劑量為100 μg/只;E組接種PBS 100 μL/只;C組接種滅活病毒100TCID50/只。首次接種后，分別在第14、28、42和56天進(jìn)行采血，分離血清備用。

2.5 免疫小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定 在第42天取各組小鼠脾臟進(jìn)行研磨，取研磨液處理后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。用1640營(yíng)養(yǎng)液(加10%小牛血清)調(diào)整細(xì)胞濃度至5×108個(gè)/L，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，每個(gè)樣品設(shè)六個(gè)重復(fù)，其中兩孔加100 μL ADV全病毒抗原，兩個(gè)孔加conA，最后兩個(gè)孔加細(xì)胞培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后每孔加入20 μL CCK-8繼續(xù)孵育4 h，測(cè)定CD450值計(jì)算刺激指數(shù)。

取1×106個(gè)細(xì)胞定容至70 μL，依次加入10 μL抗體，4 ℃避光保存30 min，1 mL FACS緩沖液重懸4 ℃ 2000 r/min離心5 min后棄上清，沉淀用300 μL FACS重懸過(guò)膜后,用流式細(xì)胞儀讀數(shù)。

2.6 免疫小鼠血清抗ADV抗體檢測(cè) 采用間接ELISA法檢測(cè)各組小鼠體內(nèi)的抗體水平，以ADV病毒包被，HRP標(biāo)記兔抗水貂IgG作為二抗。

3 結(jié)果與分析

3.1 真核重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 以實(shí)驗(yàn)室所保存的ADV分離強(qiáng)毒株DNA為模板，總上、428和446、總下分別為上下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別擴(kuò)增出大小約為3600 bp和870 bp的目的片段。以兩段PCR產(chǎn)物為模板，總上和總下為上下游引物，將兩段PCR產(chǎn)物融合為大小約為4500 bp的全長(zhǎng)基因。用相同方法，獲得同時(shí)缺失428～446位與487～501位氨基酸的融合全基因(圖1)。將融合全基因與pcDNA3.1(+)載體連接，構(gòu)建全基因突變真核重組質(zhì)粒。真核重組質(zhì)粒經(jīng)KPnI和NotI進(jìn)行雙酶切后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)大小為4500 bp的目的基因片段，與預(yù)期結(jié)果相符(圖2)。

泳道1：總1-428段PCR產(chǎn)物；泳道2：446-總2段PCR產(chǎn)物；泳道3：切除428～446段融合產(chǎn)物；泳道4：250bp Ladder；泳道5：總1-487段PCR產(chǎn)物；泳道6:501-總2段PCR產(chǎn)物；泳道7：切除428～446、487～501段融合產(chǎn)物圖1 PCR和融合結(jié)果圖

泳道1：DL15000;泳道2：pcDNA3.1-ADV-428雙酶切產(chǎn)物；泳道3：pcDNA3.1-ADV-428-487雙酶切產(chǎn)物圖2 酶切結(jié)果圖

3.2 真核重組質(zhì)粒間接免疫熒光鑒定 將構(gòu)建全基因突變重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ADV-428、pcDNA3.1-ADV-428-487分別轉(zhuǎn)染至L929細(xì)

胞后，經(jīng)熒光染色,觀察結(jié)果顯示, 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞中均出現(xiàn)了特異性熒光,而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中則無(wú)熒光，說(shuō)明構(gòu)建的上述兩種重組質(zhì)粒在L929細(xì)胞中成功表達(dá)了目的蛋白(圖3)。3.3 免疫小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定 計(jì)算各組刺激指數(shù)，制作柱形圖(圖4)，由結(jié)果可見(jiàn)，A、B兩組實(shí)驗(yàn)組和滅活苗組經(jīng)ADV刺激的淋巴細(xì)胞增殖效果要高于conA刺激組。而空載體組和PBS組ADV刺激的淋巴細(xì)胞增殖效果要弱于conA刺激。

經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)后，各組小鼠脾臟CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群含量見(jiàn)表2、圖5，三免后各組CD3+T淋巴細(xì)胞亞群含量，兩實(shí)驗(yàn)組和滅活疫苗組與空白組差異極顯著，A組與空載體組差異顯著，B、C組與空載體組差異顯著。三免后CD4+T淋巴細(xì)胞亞群含量C組與空載體組差異顯著。三免后CD8+T細(xì)胞亞群含量B組與空白組和空載體組都差異極顯著。

圖3 重組質(zhì)粒在L929細(xì)胞中的表達(dá)(400×)

圖4 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖比較

組別T淋巴細(xì)胞亞群含量/%CD3+CD4+CD8+A組46．1333±4．8335##??70．5333±5．896824．9333±4．1004B組42．9333±2．0502#??62．9667±2．573533．4667±1．6862##??C組40．6000±2．7713??#67．6333±5．6439#28．1667±5．6977D組24．7667±2．771359．6333±1．209626．4667±1．0693E組18．1333±0．838760．3667±0．929225．8000±1．0583

注：每組中的值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，*表示與PBS組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與PBS組差異極顯著(P<0.01)。#表示與pcDNA3.1空載體組相比差異顯著(P<0.05)A：pcDNA3.1-ADV-428 B：pcDNA3.1-ADV-428-487 C：滅活疫苗 D：空載體 E：PBS

圖5 T淋巴細(xì)胞亞群含量比較

3.4 免疫小鼠血清抗ADV抗體檢測(cè) 結(jié)果如圖6所示。圖為各組小鼠分別在第14、28、42、56天的抗體水平，A、B兩實(shí)驗(yàn)組和C滅活苗組在第14天后抗體已經(jīng)有上升趨勢(shì)，在第42天達(dá)到峰值，隨后開(kāi)始下降。空載體組和PBS組，一直比較平緩，抗體水平?jīng)]有明顯的變化。

圖6 小鼠血清抗ADV抗體折線圖

4 討論與小結(jié)

水貂阿留申病能引起母貂空懷和仔貂死亡，使公貂的交配能力下降，感染水貂毛皮質(zhì)量下降，給水貂養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，是養(yǎng)貂產(chǎn)業(yè)的三大疫病之一。由于其特殊的致病機(jī)理導(dǎo)致水貂阿留申病傳統(tǒng)疫苗的研制非常困難，目前尚沒(méi)有非常有效的對(duì)抗水貂阿留申病的疫苗。本實(shí)驗(yàn)著眼于第三代新型疫苗——DNA疫苗的研究，針對(duì)其免疫效果好、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)[12]研究對(duì)抗水貂阿留申病的新型疫苗。

水貂阿留申病病毒為單股線狀DNA病毒,基因組編碼有2個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2)，2個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2),也可能存在NS3[13-14]。水貂阿留申病毒結(jié)構(gòu)蛋白在病毒感染和引起免疫反應(yīng)過(guò)程中起關(guān)鍵作用,非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒轉(zhuǎn)錄與復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究表明，ADV NS1、VP2以及部分VP2片段的原核表達(dá)產(chǎn)物能引起較好的免疫反應(yīng)，但是針對(duì)強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)效果欠佳。Y Castelruiz等[15]所做研究中將NS1片段與真核表達(dá)載體連接制作的核酸疫苗在給水貂免疫后能起到部分保護(hù)效果,但保護(hù)力不足。與這些研究相比本試驗(yàn)采用ADV全基因，通過(guò)切除片段、重組并與真核表達(dá)載體連接構(gòu)建全基因突變重組質(zhì)粒。BLOOM等[16]所發(fā)表的文章以ADV VP2中各短序列作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象制作單克隆和多克隆抗體，以研究ADV各短序列在感染水貂的過(guò)程中所發(fā)揮的作用，結(jié)果表明，VP2蛋白428～446位肽段制備的單克隆抗體和多克隆抗體可產(chǎn)生明顯的抗原抗體復(fù)合物反應(yīng)，而且428～446位肽段可能存在感染水貂的主要抗原表位，并能介導(dǎo)ADE反應(yīng)的發(fā)生，所以428～446位肽段可能在ADV的致病機(jī)理中發(fā)揮著重要作用，而487～501位肽段形成復(fù)合粒子的水平類似于428～446位肽段。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了截去428～446位氨基酸的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ADV-428和同時(shí)截去428～446位、487～501位氨基酸的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ADV-428-487。經(jīng)間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，表明所構(gòu)建的重組質(zhì)粒可在體外成功表達(dá)蛋白。在免疫小鼠后的抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)初期五組實(shí)驗(yàn)小鼠血清內(nèi)的抗體水平比較接近，隨后所構(gòu)建的重組質(zhì)粒與滅活疫苗組開(kāi)始呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并在第42天達(dá)到峰值，而空載體組與PBS組都無(wú)明顯變化，證明兩重組質(zhì)粒能成功誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的體液免疫。在小鼠的脾臟T淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定中，pcDNA3.1-ADV-428、pcDNA3.1-ADV-428-487都對(duì)小鼠產(chǎn)生了明顯的刺激反應(yīng)，各組小鼠脾臟CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群含量比較，實(shí)驗(yàn)組CD3+、CD4+的含量值要明顯高于空載體組和空白組，實(shí)驗(yàn)組的CD8+T含量略高于空載體組與空白組，表明所構(gòu)建的重組質(zhì)粒能引起小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答。本試驗(yàn)所構(gòu)建的兩種重組質(zhì)粒，在試驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的反應(yīng)原性和免疫原性。

后續(xù)試驗(yàn)將研究pcDNA3.1-ADV-428 和pcDNA3.1-ADV-428-487兩種重組質(zhì)粒對(duì)靶動(dòng)物的免疫效果，觀察其接種水貂后，對(duì)水貂的保護(hù)情況，以期為水貂阿留申病核酸疫苗的研究奠定一定的基礎(chǔ)。

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(編輯：侯向輝)

ADV Isolated Virulent Strain Construction Expression and Immunogenicity Analysis of Whole Gene Mutation Recombinant Plasmids

SUN Li-jie1, LIU Dong-xu1, LI Jian-ming1, SHI Kun1, LENG Xue1, LI Dong1, DU Rui2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China；2.GraduateSchoolofJilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China)

For the development of mink Aleutian disease nucleic acid vaccine, the nucleotide sequences encoding 428～446 bit amino acids in the ADV VP2 gene are removed by using the overlap extension PCR technique, with pcDNA3.1 (+) carrier connection,construct the whole gene mutation recombinant plasmid pcDNA3.1-ADV-428,on this basis, nucleotide sequences of 487～501 amino acid at position is truncated coding, construct the whole gene mutation recombinant plasmid pcDNA3.1-ADV-428-487.The recombinant plasmid was constructed by intramuscular injection of immune mice, anti ADV antibody levels were detected in 14 days, 28 days, 42 days, and 56 days after inoculation by indirect ELISA method; Detection of CD3+, CD4+and CD8+T lymphocyte subsets in spleen cells of mice forty-second days after inoculation by flow cytometry. Results showed that the number of CD3+, CD4+and CD8+T lymphocyte subsets in mice inoculated with plasmid were significantly increased, anti ADV antibody level reached peak at forty-second days. In this experiment, the immunogenicity of the recombinant plasmid of ADV gene mutation was tested to provide reference for the development of mink Aleutian disease nucleic acid vaccine.

aleutian disease of mink; eukaryotic expression vector; immunogenicity；reactionogenicity

國(guó)家自然基金(NO.31272565)

孫利杰，碩士研究生，從事經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病的研究。

杜銳。E-mail：durui197107@sian.com

2016-03-24

A

1002-1280 (2016) 06-0009-07

S858.299