衍生氣相色譜法測定雞疫苗中游離甲醛的含量

張璐，馬秋冉，戴青，董玲玲，趙富華，楊星，于曉輝

(中國獸醫藥品監察所，北京100081)

衍生氣相色譜法測定雞疫苗中游離甲醛的含量

張璐，馬秋冉，戴青，董玲玲，趙富華，楊星，于曉輝*

(中國獸醫藥品監察所，北京100081)

建立了雞疫苗中游離甲醛含量測定的衍生氣相色譜法。用2,4-二硝基苯肼衍生雞疫苗中的游離甲醛后，環己烷萃取衍生物，HP-5毛細管色譜柱分離，氣相色譜分析，電子捕獲檢測器檢測，外標法定量。游離甲醛質量濃度在0.05～5 mg/L內與峰面積呈良好的線性關系，回歸方程為Y=2781.9X+14.525 (r=0.9999)。平均加樣回收率為99.44%(RSD=1.87%)。本方法準確穩定，靈敏度高，重復性好，可用于雞疫苗中游離甲醛的含量測定。

雞疫苗；甲醛；2,4-二硝基苯肼衍生化；氣相色譜法

甲醛是在雞疫苗抗原滅活過程中用到的最傳統、最廣泛的化學滅活劑[1]，是一種熔點-92 ℃、沸點-21 ℃的原生質毒素，疫苗中高甲醛殘留將會影響雞的健康。有研究表明，若抗原滅活后甲醛去除不徹底，將導致雞疫苗中甲醛含量過高，引起雞雌激素分泌下降，這可能是造成產蛋性能下降的主要因素之一[2]。因此，需要對雞疫苗甲醛殘留量進行嚴格控制。

目前，對于甲醛的含量測定主要采用分光光度法、氣相色譜法、液相色譜法等[3]。2010年版《中華人民共和國獸藥典》三部收錄的雞疫苗中甲醛殘留量的測定方法為乙酰丙酮分光光度法[4]，其存在的問題是很多雞疫苗中含有有色物質，這些有色物質會對試驗結果產生干擾，影響甲醛含量的準確測定。文獻中尚未見采用氣相色譜法測定雞疫苗中甲醛含量的相關報道。本研究以雞新城疫滅活疫苗為供試品，建立了測定雞疫苗中游離甲醛含量的衍生氣相色譜法，并應用該方法分別測定了四種雞疫苗中甲醛的含量，這四種疫苗類型包括油苗、水苗及含有有色物質的疫苗等。

1 材料與方法

1.1 儀器和設備 Agilent 7890A氣相色譜儀及7693自動進樣系統；HP-5毛細管色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；分析天平：感量0.00001 g；KQ3200型超聲波清洗器；渦旋混合儀；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋。

1.2 試劑和甲醛標準品 甲醛溶液(含量37.0%～40.0%，經標定甲醛含量為37%[4]，國藥集團化學試劑有限公司，批號：141120)。雞新城疫滅活疫苗(批號：2015003)、豬細小病毒滅活疫苗NJ株(批號：20150002)、瑞仔健豬細小病毒病滅活疫苗(批號：1406003)、豬多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗(批號：153503)。2,4-二硝基苯肼(2,4-DNPH)、鹽酸、環己烷、吐溫-80、乙醇均為分析純。吐溫-80購自香港GFCO化學品供應，其余購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 色譜條件 采用HP-5毛細管柱，升溫程序：初始溫度為150 ℃，保持1 min，以每分鐘20 ℃的速率升溫至250 ℃，保持6 min；進樣口溫度為300 ℃，隔壁吹掃3 mL/min，分流比為50︰1；電子捕獲檢測器(ECD)檢測器，檢測器溫度為350 ℃，尾吹60 mL/min。載氣為N2，流量為2 mL/min；進樣量為1 μL。

1.4 溶液的配制

1.4.1 衍生化試劑 取2,4-DNPH 0.3 g置100 mL棕色容量瓶中，加入質量分數為22%的鹽酸60 mL，超聲使溶解，搖勻，加水稀釋至刻度，制成2,4-DNPH衍生化試劑。

1.4.2 對照品儲備液 精密稱取甲醛溶液適量置100 mL容量瓶中，用水稀釋并定容至刻度，搖勻。從中取10.0 mL于100 mL容量瓶中，用水稀釋并定容至刻度，搖勻，制成0.1 mg/mL的甲醛對照品儲備液，臨用前按需稀釋配制。1.4.3 供試品溶液 精密量取雞新城疫滅活疫苗(油苗)5.0 mL，置50 mL容量瓶中，用20%吐溫-80乙醇溶液10 mL，分次洗滌吸管，洗液并入50 mL量瓶中，搖勻，加水稀釋至刻度，強烈振搖，置分液漏斗中靜置分層，吸取下層溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，制成供試品溶液[4]。

1.5 樣品的衍生化處理方法 精密吸取對照品或供試品溶液各1.0 mL，分別置15 mL離心管中，加入2,4-DNPH衍生化試劑1 mL，渦旋1 min，超聲5 min，60 ℃保溫45 min，迅速冷卻，精密加入環己烷3.0 mL，渦旋萃取1 min，靜置分層后取上層液置氣相小瓶中，供氣相色譜法測定。

2 方法學驗證

2.1 樣品的衍生化反應條件優化 紀宏等[3]在用衍生化氣相色譜法測定重組乙型肝炎疫苗中游離甲醛含量時，對甲醛衍生化方法進行考察，試驗表明超聲時間、衍生化溫度對衍生化結果影響不大，以環己烷作為萃取劑萃取率高于正己烷14%。 為保證衍生過程反應充分、衍生化產物萃取完全，取對照品溶液(1 mg/L)，分別比較了衍生時間(30、45、60 min)、衍生化劑加入量(1、2、3 mL)、萃取劑加入量(2.0、3.0、4.0 mL)等因素對衍生化后測定靈敏度的影響，見圖1。為保證充分反應且節省時間，綜合紀宏等[3]的研究結果，確定衍生時間為45 min。比較衍生劑加入量和萃取劑加入量對含量測定結果的影響，最終確定加入1 mL的衍生劑，萃取劑為3.0 mL環己烷。

圖1 衍生化條件的考察結果

2.2 色譜系統的專屬性 取雞新城疫滅活疫苗供試品溶液，首先按1.5項下處理樣品，然后按1.3項下色譜條件測定，游離甲醛衍生物與相鄰最近色譜峰的分離度均大于6.0，理論塔板數大于200000，主峰保留時間約為5.53 min?？梢娫撓到y能夠滿足甲醛衍生物和其他雜質成分達到基線分離的要求(圖2)。

A 空白；B 對照品；C 供試品圖2 游離甲醛衍生化氣相色譜圖

2.3 標準曲線 取適量甲醛對照品儲備液，加水稀釋成濃度為0.05、0.1、0.2、0.3、1、2、3、5 mg/L的系列溶液。按1.5項下衍生化，供氣相色譜分析。以各色譜峰的峰面積為縱坐標，對照溶液濃度為橫坐標，進行線性回歸，繪制標準曲線(圖3)得到回歸方程Y=2781.9X+14.525(r=0.9999)。表明游離甲醛含量在0.05～5 mg/L范圍內，與峰面積呈良好的線性關系。

圖3 甲醛標準曲線圖

2.4 精密度試驗 取對照品溶液(1 mg/L)，按1.5項下衍生化后，照1.3項下色譜條件重復進樣6次，記錄色譜圖，按峰面積計算RSD為1.34%。表明儀器精密度良好。

2.5 重復性試驗 精密取同一供試品溶液6份(批號：2015003)各5.0 mL，分別置50 mL容量瓶中，按1.4.3項下稀釋定容后。吸取1.0 mL，置于15 mL離心管中，按1.5項下衍生化，照1.3項下色譜條件測定，計算游離甲醛平均含量為0.0701 mg/mL，RSD值為1.82%，表明該方法重復性好。

2.6 定量限的確定 精密吸取質量濃度為1 mg/L的對照品溶液1.0 mL，用水逐步稀釋得到質量濃度為0.5 、0.1、0.05 mg/L的溶液，按1.5項下衍生化后，以1.3色譜條件測定。試驗結果表明，在滿足信噪比大于10︰1時，0.05 mg/L甲醛溶液的基線波動與空白溶液的基線波動接近，故確定甲醛的最低定量限為0.05 mg/L。

2.7 甲醛衍生化產物的穩定性考察 精密吸取已知濃度的供試品溶液1.0 mL，按1.5項下衍生化后，將待測樣品放入氣相小瓶，密封瓶口，置4 ℃冰箱中，分別在0、2、4、6、8、12、24 h時測定峰面積(測定峰面積前要將供試品溶液放置至室溫)。計算峰面積平均值為1941，RSD值為0.85%，表明甲醛衍生化產物24 h內測定較為穩定。

2.8 加樣回收率試驗 精密量取6份2.5 mL濃度為0.0701 mg/mL的供試品試液，分別置50 mL容量瓶中，加入0.1 mg/L的甲醛溶液1.8 mL，按1.5項下衍生化后，照1.3項下色譜條件測定。結果顯示，加樣回收率在96.72%～102.22%之間，RSD為1.87%，表明該方法回收率高(表1)。

表1 甲醛的加樣回收率實驗結果(n=6)

2.9 樣品中游離甲醛含量的測定 取各樣品溶液，按1.5項下衍生化后，照1.3項下色譜條件測定，計算雞疫苗中游離甲醛含量(表2)。試驗結果表明，4批雞疫苗中游離甲醛含量的測定結果與本課題組新開發的利用紫外可見分光光度法、高效液相色譜法所測得的甲醛含量基本一致。

表2 雞疫苗中游離甲醛含量測定結果

3 討論與小結

為建立甲醛氣相色譜條件，試驗前期對色譜柱、進樣口溫度、色譜柱溫度、檢測器、檢測器溫度等因素進行了系統考察。使用不同極性的色譜柱，色譜柱型號包括DB-1、HP-5、DB-WAX，結合甲醛或甲醛衍生物的性質，在不同進樣口溫度(200～300 ℃)、色譜柱溫度(150～250 ℃)、檢測器溫度(250～350 ℃)下，使用FID或ECD檢測器，探究氣相色譜對甲醛或甲醛衍生物的分離測定情況。試驗結果表明，HP-5型色譜柱分別對甲醛或甲醛衍生物的分離效能最好。進樣口溫度、色譜柱溫度及檢測器溫度只要在上述范圍內，可確保檢測器對甲醛或甲醛衍生物有響應。但對響應值起決定性因素的，是檢測器的選擇。試驗結果表明，FID檢測器對甲醛靈敏度極低，對甲醛衍生化產物幾乎無響應。而ECD檢測器對甲醛衍生化產物非常靈敏，有極低的檢測限。故測定甲醛含量應使甲醛與2,4-DNPH衍生化后，使用ECD檢測器進行檢測。

綜上所述，本文建立了測定雞疫苗中游離甲醛含量的衍生氣相色譜法。實驗結果表明，本方法線性范圍廣，精密度好，準確度高，可以用于雞疫苗中游離甲醛的含量測定。

[1] 徐守振, 尹燕博, 王新. 動物疫苗中常用抗原滅活劑的研究進展[J]. 中國畜牧獸醫, 2010, 37(9): 162-167.

[2] 孟迪, 劉哲翔, 曹金元, 等. 禽流感滅活疫苗甲醛含量測定及對產蛋雞雌二醇的影響[J]. 中國獸醫雜志, 2008, 44(5): 86-87.

[3] 紀宏, 馬迅, 祁進, 等. 衍生化GC法測定重組乙型肝炎疫苗中游離甲醛的含量[J]. 沈陽藥科大學學報, 2015, 32(4): 289-293.

[4] 中華人民共和國獸藥典[M]. 2010年版. 北京: 中國農業出版社.

(編輯：李文平)

Determination of Free Formaldehyde in Poultry Vaccine by Derivatization Capillary GC

ZHANG Lu，MA Qiu-ran，DAI Qing，DONG Ling-ling， ZHAO FU-hua，YANG Xing，YU Xiao-hui*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugsControl，Beijing100081,China)

A GC method for the determination of free formaldehyde in poultry vaccine has been developed. The samples were derivatized by 2,4-dinitrophenylhydrazine, extracted by cyclohexane, purifid with HP-5 capillary column, seperated by GC with an electron capture detector and qualified by external standard calibration curves. The free formaldehyde in the vaccine showed a good linear relationship to peak area within a concentration range of 0.05～5 mg/L, the regression equation was:Y=2781.9X+14.525(r=0.9999). The average recovery using the established method was 99.44% (RSD=1.87%). The derivatization capillary gas chromatography method is developed, which is accurate, stable, sensitive, reproducible and might be used for determination of free formaldehyde in poultry vaccine.

poultry vaccine; formaldehyde; 2,4-dinitrophenylhydrazine derivative; GC

張璐，碩士，從事獸藥檢驗及相關研究。

于曉輝。E-mail：yuxiaohui@ivdc.org.cn

2015-05-25

A

1002-1280 (2016) 07-0030-04

S858.31